萝卜硫素对心肌缺血再灌注损伤大鼠IRE-1/XBP-1通路及心肌凋亡的影响

王帅，邢彩耐，邬鹏宇，崔志成，赵长全

心肌缺血再灌注损伤（MIRI）属临床常见症状，随着人民生活方式改变，发病率逐渐升高，且呈年轻化趋势，危害生命健康[1]。再灌注改善心肌供血的同时可产生一系列病理现象，包括过氧化反应及炎症反应等，出现不可逆的细胞凋亡和坏死[2]，因此细胞凋亡可反映MIBI疾病损伤情况，减少细胞损伤对于缓解疾病具有重要意义。萝卜硫素（SFN）是一种异硫氰酸酯类家族药物，具有抗氧化活性、抗肿瘤等功效，近年研究发现其在心肌细胞中具有抑制心肌细胞凋亡、氧化应激作用，从而缓解心肌损伤[3]，但具体机制尚不明确。肌醇需求酶1（IRE-1）/X-盒结合蛋白-1（XBP-1）通路调控多种炎症因子表达，同时影响细胞凋亡，是内质网上重要通路[4]，推测SFN影响IRE-1/XBP-1通路实现对心肌细胞凋亡的影响。因此，SFN、IRE-1特异性抑制剂STF-083010预处理大鼠后，建立MIRI模型，初步探究SFN影响MIRI心肌细胞凋亡的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物Wistar雄性大鼠50只，南京君科生物有限公司提供，合格证号：SCXK（苏）2019-0021，体质量220～240 g，SPF级。所有大鼠均在20～25℃，湿度40%～60%，12 h自然光照，自由饮水摄食条件下暂养，7 d后用于实验研究。本实验经本院伦理会审核并通过。

1.2 试剂与仪器SFN（上海原叶生物有限公司，批号：121-42-3）；IRE-1特异性抑制剂STF-083010（美国Selleck公司，CAS号：307543-71-1）；苏木精-伊红（HE）染色试剂盒、一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（绿色荧光）（碧云天生物技术有限公司，货号：C0105、C1086）；2×Hi SYBR Green QPCR Mix（日本TaKaRa公司，货号：ARR041A）；一抗兔抗IRE-1、p-IRE-1、XBP-1、β-actin（英国abcam公司，货号：ab37073、ab48187、ab37152、ab8226）。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase3）、B淋巴细胞瘤-2基因（BCL2）、Bcl-2相关X蛋白（BAX）、β-actin引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）仪（赛默飞世尔，型号：StepOnePlus Real-Time PCR system）。

1.3 研究方法

1.3.1 实验分组及造模实验分为假手术组、模型组、SFN组、STF-083010组、SFN+STF-083010组共五组，每组10只。实验前STF-083010经DMSO溶解后生理盐水稀释至3 g/L。冠状动脉左室支结扎前2 h，SFN组尾静脉注射5 mg/kg SFN[5]，STF-083010组腹腔注射30 mg/kg STF-083010[6]，SFN+STF-083010组在SFN组基础上腹腔注射30 mg/kg STF-083010，假手术组、模型组尾静脉和腹腔注射等体积生理盐水。

除假手术组外参考文献[7]建立MIRI模型，40 mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，气管插管，小动物呼吸机机械通气。剖开腹腔暴露出心脏，分离右侧颈总动脉，心导管经右侧颈动脉插入左心室。胸骨左缘2～3 mm处切口，第4肋间夹闭肋间血管暴露左心耳及左心室。左心耳下缘2 mm以无创小圆针带6-0丝线进针穿过冠状动脉左降支下方心肌表层，缝线两端引出硅胶套管（硅胶套管一端紧贴左心室壁），收紧结扎线持续缺血30 min；松开结扎线再灌注2 h。模型建立成功的标志：收紧结扎线30 min时出现心肌组织发绀或苍白，心电图检测ST段抬高现象；再灌注后心脏缺血区域变红，ST段降低超过50%。假手术组仅打开胸腔暴露出心脏穿丝线而不结扎。

1.3.2 TTC染色检测心肌梗死情况待大鼠自主呼吸，将大鼠置于笼中，次日清晨处死大鼠，每组大鼠随机4只迅速摘除心脏，平行心室横切成5片，1%TTC磷酸缓冲液中37℃孵育20 min，10%甲醛室温固定1 h。拍照观察，正常心肌呈红色，梗死区呈白色。Image-J软件分析梗死体积，梗死体积百分比=白色区体积/心肌组织体积×100%。

1.3.3 HE染色观察大鼠心肌组织形态学情况每组剩余6只大鼠迅速摘除心脏，部分置于4%多聚甲醛中固定，固定后切片；部分置于-80℃冰箱中保存待用。部分切片严格按照试剂盒说明书进行染色，中性树胶封片，显微镜拍照观察。

1.3.4 TUNEL染色观察心肌组织细胞凋亡情况部分切片按照TUNEL细胞凋亡检测试剂盒说明书对心肌组织凋亡细胞染色，DAPI染色细胞核。采用荧光显微镜观察组织染色情况，利用Image-J软件评定阳性染色细胞数量百分比，则细胞凋亡率=阳性染色细胞数/细胞总数×100%。

1.3.5 qRT-PCR检测心肌组织中caspase3、BCL2、BAX mRNA表达取部分心肌组织，TRIZOL法提取总RNA，cDNA合成试剂盒合成cDNA，qRT-PCR仪检测心肌组织中caspase3、BCL2、BAX mRNA水平。引物序列caspase3 F：5’-GCAGCAGCCTCAAATTGTTGAC-3’、R：5’-TGCTCCGGCTCAAACCATC-3’，BCL2 F：5’-CCTTTGTGTAACTGTACGGCC-3’、R：5’-CTTTGGCAGTAAATAGCTGATTCGAC-3’，BAX F：5’-GGATGCGTCCACCAAGAA-3’、R：5’-TCCCGGAGGAAGTCCATT-3’，β-actin F：5’-TGCTATGTTGCCCTAGACTTCG-3’、R：5’-GTTGGCATAGAGGTCTTTACGG-3’。qRT-PCR仪扩增，上样体系：2×Mix 1 μl、F/R（10 μM）各0.5 μl、ddH2O 8.0 μl。扩增程序：95℃，5 min；94℃、20 s，61℃、65 s，40个循环，采用2-△△CT法计算caspase3、BCL2、BAX mRNA相对表达量。

1.3.6 免疫印迹法检测心肌组织中IRE-1、p-IRE-1、XBP-1蛋白表达取部分心肌组织，RIPA裂解液冰上研磨组织并裂解20 min，4℃离心机10 000g离心20 min，收集上清为总蛋白，上样20 ng行SDS-PAGE，转膜后一抗IRE-1、p-IRE-1、XBP-1、β-actin 4℃孵育过夜，加入对应二抗，ECL化学发光液显色，Image-J软件定量扫描蛋白条带灰度值，蛋白相对表达水平=待测蛋白灰度值/相对蛋白灰度值。

1.4 统计学处理所有数据采用SPSS 25.0软件进行分析。计量资料以均数±标准差（）描述，多组间比较行单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SFN对大鼠心肌梗死的影响与假手术组相比，模型组心肌梗死体积百分比升高（P＜0.05）；与模型组比较，SFN组、STF-083010组、SFN+STF-083010组心肌梗死体积百分比降低（P＜0.05）；分别与SFN组、STF-083010组比较，SFN+STF-083010组心肌梗死体积百分比降低（P＜0.05），见图1及表1。

表1 5组大鼠心肌梗死体积百分比的比较（n=4）

图1 5组大鼠心肌梗死情况

2.2 SFN对大鼠心肌组织形态的影响假手术组心肌细胞形态正常，整齐，细胞无破损等现象；模型组心肌细胞排列紊乱，细胞膜破坏严重，细胞核部分散落在外；SFN组心肌细胞排列紊乱部分缓解，见少量细胞核散落；STF-083010组心肌细胞排列紊乱，细胞核散落严重；SFN+STF-083010组细胞排列恢复正常，排列整齐（图2）。

图2 5组大鼠心肌组织形态情况（400×）

2.3 SFN对大鼠心肌组织细胞凋亡的影响与假手术组比较，模型组心肌组织细胞凋亡率升高（P＜0.05）；与模型组比较，SFN组、STF-083010组、SFN+STF-083010组心肌组织细胞凋亡率降低（P＜0.05）；分别与SFN组、STF-083010组比较，SFN+STF-083010组心肌组织细胞凋亡率降低（P＜0.05），表2。

表2 5组心肌组织细胞凋亡率比较（n=6）

2.4 SFN对大鼠心肌组织中caspase3、BCL2、BAX mRNA水平的影响与假手术组比较，模型组心肌组织中caspase3、BAX mRNA水平升高，BCL2 mRNA水平降低（P＜0.05）；与模型组比较，SFN组、STF-083010组、SFN+STF-083010组心肌组织中caspase3、BAX mRNA水平降低，BCL2 mRNA水平升高（P＜0.05）；与SFN组比较，SFN+STF-083010组心肌组织中BAX mRNA水平降低，与STF-083010组比较，SFN+STF-083010组心肌组织中caspase3、BAX mRNA水平降低，BCL2 mRNA水平升高（P＜0.05），表3。

表3 5组心肌组织中caspase3、BCL2、BAX mRNA水平比较（n=6）

2.5 SFN对大鼠心肌组织中IRE-1、p-IRE-1、XBP-1蛋白的影响5组心肌组织中IRE-1蛋白差异无统计学意义（P＞0.05）。与假手术组比较，模型组心肌组织中p-IRE-1/IRE-1、XBP-1蛋白水平升高（P＜0.05）；与模型组比较，SFN组、STF-083010组、SFN+STF-083010组心肌组织中p-IRE-1/IRE-1、XBP-1蛋白水平降低（P＜0.05）；分别与SFN组、STF-083010组比较，SFN+STF-083010组心肌组织中p-IRE-1/IRE-1、XBP-1蛋白水平降低（P＜0.05）见图3及表4。

图3 5组心肌组织中IRE-1、p-IRE-1、XBP-1蛋白水平

表4 5组心肌组织中IRE-1、p-IRE-1、XBP-1蛋白水平比较（n=6）

3 讨论

MIRI造成的心肌细胞凋亡是心肌损伤的最终末发病环节，是导致心肌纤维化、心律失常、心室重构、心衰的重要因素，因此，衡量MIRI关键在于心肌细胞凋亡情况是否缓解[8]。本研究发现，与假手术组相比，模型组脑梗死体积比例升高，心肌细胞排列紊乱，细胞膜破坏严重，细胞核部分散落在外，心肌细胞凋亡率升高，提示MIRI造成心肌组织出现病变，心肌细胞膜破裂，细胞核暴露在外，心肌细胞损伤严重，凋亡严重。SFN作为存在于十字花科植物中天然抗氧化剂，是迄今发现的抗氧化能力较强的物质之一，可调控多种氧化还原敏感转录因子实现对机体的保护，在MIRI中可改善心室功能、减少心肌梗死体积、减少心肌细胞凋亡[9]。与模型组比较，SFN组脑梗死体积比例降低，心肌细胞排列紊乱部分缓解，见少量细胞核散落，细胞凋亡率降低，提示SFN可缓解心肌细胞破坏严重现象，减少细胞凋亡，实现对心肌细胞的保护。

细胞凋亡经典途径主要有三条：死亡受体途径、线粒体途径和内质网途径[10]，但最终都激活凋亡执行蛋白caspase3促进细胞凋亡，caspase3水平反映细胞凋亡情况[11]；抑制caspase3的表达可减轻MIRI心肌细胞凋亡状况，减少心肌组织损伤、降低心肌梗死体积，实现对心肌组织的保护[12,13]。BCL2家族蛋白在细胞凋亡过程中起重要的调控作用，BCL2抗凋亡、BAX促凋亡，BAX结合BCL2，拮抗BCL2促凋亡，相互协调，激活下游基因发挥作用[14]。BAX水平升高时会形成大量的BAX同源二聚体，诱导Cyt-C释放至细胞质中，经一系列反应酶切caspase3酶原，激活caspase3活化，启动caspase3级联反应，进而诱导细胞凋亡[15]。本研究发现，与假手术组相比，模型组心肌组织中caspase3、BAX mRNA水平升高，BCL2 mRNA水平降低，提示心肌组织中心肌细胞破坏损伤刺激BAX水平升高，BAX形成大量的同源二聚体通过一系列反应刺激caspase3活化，启动caspase3级联反应，诱导心肌细胞凋亡，加重疾病进程。

内质网应激是细胞凋亡的一个主要途径，负责蛋白合成、折叠、组装的内质网在外部刺激下错误折叠、组装，导致蛋白在内质网上聚集而诱发内质网应激，内质网不能通过自我调节而恢复其功能时就会诱发细胞凋亡或细胞程序性死亡[16]。内质网应激主要通过PERK/eIF2α通路、IRE-1/XBP-1通路、ATF6通路介导反应，其中IRE-1是介导内质网应激的核心调控因子，活化IRE-1后可诱导损伤[17]；XBP-1是IRE-1下游应激相关因子，与内质网折叠、内质网结构构造相关，IRE-1剪接作用下XBP-1 mRNA特异位点减去一个26bp长度的内含子，改变XBP-1阅读框，转录成有活性的XBP-1发挥作用[18]，XBP-1激活如CHOP、GRP78等转录因子表达从而下调BCL2水平，发挥凋亡作用[19,20]。本研究发现，与假手术组相比，模型组心肌组织中p-IRE-1/IRE-1、XBP-1蛋白水平升高，提示心肌损伤导致内质网应激，IRE-1活化促进XBP-1阅读框改变而转录成有活性的XBP-1，激活下游转录因子下调BCL2、上调BAX，激活caspase3活化，启动级联反应从而诱导心肌细胞凋亡，加重MIRI。与模型组相比，SFN组、STF-083010组、SFN+STF-083010组心肌组织中p-IRE-1/IRE-1、XBP-1蛋白水平降低；分别与SFN组、STF-083010组相比，SFN+STF-083010组心肌组织中p-IRE-1/IRE-1、XBP-1蛋白水平降低。提示SFN与STF-083010功能类似，可抑制IRE-1活化，从而使活性XBP-1水平降低，XBP-1减弱对下游转录因子的影响，转录因子对BCL2、BAX作用减弱，caspase3活性降低，从而降低心肌细胞凋亡，实现对MIRI的保护。

综上所述，SFN与IRE-1抑制剂作用类似，均可抑制心肌细胞凋亡，实现对MIRI的保护，因此SFN可能通过抑制IRE-1/XBP-1通路发挥作用。但XBP-1下游转录因子较多，通过具体转录因子对BCL2、BAX的影响是本文进一步研究重点。