鸡胚接毒量对新城疫病毒LaSota 株增殖的探究

胡江锋 胡春艳 张小娟

1.杨凌绿方生物工程有限公司 712100

2.陕西省兽用生物制品工程技术研究中心 712100

3.陕西诺威利华生物科技有限公司 712100

鸡新城疫（ND）是由新城疫病毒（NDV）引起的一种急性、高度接触性传染病，主要侵害鸡和火鸡，其他禽类和野禽也能感染，亦可感染人。本病于1926 年首次发现于印度尼西亚，随后又发现于英国的新城，我国最早的报道见于1935 年的河南，20 世纪50 年代本病在全国各地广泛流行。本病常呈败血症经过，其特征是呼吸困难、下痢和神经症状，死亡率高，可造成很大的经济损失。本病是危害我国养禽业最严重的禽病之一，世界动物卫生组织（OIE）将其列为必须报告的动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。动物传染病防控的主要环节是消灭传染源、切断传播途径和保护易感畜禽，疫苗免疫是保护畜禽健康的重要措施。鸡新城疫疾病的预防主要依靠疫苗免疫来提高机体的抗病力，实现保护畜禽健康的目的。目前，我国生产的鸡新城疫疫苗有活疫苗和灭活疫苗两大类，活疫苗用于鸡群前期的基础免疫，灭活疫苗用在鸡群后期的加强免疫。不论活疫苗还是灭活疫苗，广泛使用NDV-LaSota 株种毒接种鸡胚进行病毒增殖，收获鸡胚液作为制苗用抗原。疫苗的抗原含量越高，刺激机体产生的抗体越多，保护力也越强，因此，病毒抗原含量是保障疫苗质量的关键，另外鸡胚的抗原收获量影响着生产成本。此试验从鸡胚的接毒量入手，探索出了SPF 鸡胚生产NDV-LaSota 株抗原时，鸡胚适宜接毒量的量化指标，不但给实际生产提供了指导依据，而且所生产的病毒抗原含量和收获量均有了提高，保证了产品质量，而且降低了生产成本，有利于鸡新城疫病的防控工作。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 种毒NDV-LaSota 株，批号20210302，病毒含量—鸡胚半数感染量（EID50）≥109.38/0.1mL，由杨凌绿方生物工程有限公司质量管理部提供。

1.1.2 SPF 鸡胚SPF 鸡蛋购自济南赛福实验动物养殖有限公司，经杨凌绿方生物工程有限公司前孵化班孵化提供。

1.1.3 主要试剂生理盐水、PBS（0.1mol/L，pH7.0～7.2）、1%鸡红细胞悬液，由陕西省兽用生物制品工程技术研究中心提供。

1.1.4 主要仪器设备孵化机，青岛兴仪电子设备有限公司；冰柜，澳柯玛集团有限公司；微量板振荡器，金坛市正基仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 种毒稀释将NDV-LaSota 株种毒用生理盐水按5个组别分别稀释2.4×106、4.8×105、2.4×105、4.8×104、2.4×104倍，使0.1mL 稀释液含病毒量对应为1000EID50、5000EID50、10000EID50、50000EID50、100000EID50。

1.2.2 鸡胚接种将10 日龄的SPF 鸡胚1000 枚，随机分为5 组，200 枚/组，先用5%碘酊消毒鸡胚气室及接种点部位，1～2min 后再用75%酒精脱碘；用打孔蛋锥在接种点和气室顶部各钻一小孔。用卡介苗注射器吸取种毒稀释液，按0.1mL/胚尿囊腔接种SPF 鸡胚，接种病毒含量为1000EID50种毒稀释液的一组鸡胚，标记为A 组，接种病毒含量为5000EID50种毒稀释液的一组鸡胚，标记为B 组，接种病毒含量为10000EID50种毒稀释液的一组鸡胚，标记为C组，接种病毒含量为50000EID50种毒稀释液的一组鸡胚，标记为D 组，接种病毒含量为100000EID50种毒稀释液的一组鸡胚，标记为E 组。接种完用石蜡先封接种孔，再封气室孔。

1.2.3 孵育观察接种、封孔完毕的SPF 鸡胚置36℃～37℃、相对湿度60%～65%的孵化机继续孵育，不必翻蛋；将60h 前死亡胚弃去，60h 后每隔6～8h 照蛋一次，死亡的鸡胚随时取出，保存于2℃～8℃冰柜，至96h，不论死亡与否，全部取出，气室向上置于2℃～8℃冰柜冷却。

1.2.4 鸡胚液收获按组别分别将冷却4～24h 的SPF 鸡胚取出，先用1%新洁尔灭擦拭消毒整个鸡胚，再用5%碘酊消毒气室部位。用眼科剪刀无菌剪除气室蛋壳，再用眼科镊子揭去卵壳膜，接着刺破绒毛尿囊膜及羊膜，勿使卵黄破裂，将胚胎及卵黄移至蛋壳内一侧，同时于另一侧无菌吸取鸡胚液（尿囊液和羊水的合称），计量后置于灭菌容器中，留取样品备检。在收获鸡胚液的同时应逐个检查，凡胚胎腐败及鸡胚液混浊者弃去不用。另外，收获完一组鸡胚液，须更换工器具再收获另一组鸡胚液。

1.2.5 鸡胚液病毒含量测定将5 组检验留样用PBS 分别进行10 倍系列稀释至10-9，每组取10-7、10-8、10-93 个稀释度分别尿囊腔接种10 日龄SPF 鸡胚5 枚，0.1mL/胚，封孔后置36℃～37℃、相对湿度60%～65%的孵化机继续孵育，观察5d。接种后，48h 前死亡的鸡胚弃去不计，48～120h死亡的鸡胚随时取出，保存于2℃～8℃冰柜，至120h，取出所有活胚，气室向上置于2℃～8℃冰柜冷却4～24h 后，收取同一稀释度的死亡鸡胚胚液，混合并留样，活胚逐个收取鸡胚液样品。按红细胞凝集试验法，用96 孔微量板分别测定收获的鸡胚液留样的HA，HA≥27者判为感染，按Reed-Muench 法分别计算各组鸡胚液的EID50。

2 结果与分析

2.1 鸡胚液收获量比较各组SPF 鸡胚接毒后的孵育观察情况及鸡胚液的收获量见表1。

表1 接毒鸡胚的孵育观察情况及鸡胚液收获量

从表1 看出，用SPF 鸡胚生产NDV-LaSota 株抗原时，随着鸡胚接毒量的增大，其60～96h 区间死亡的鸡胚也逐渐增多，96h 存活鸡胚相应逐渐减少，收获的鸡胚液总量也逐渐减少。说明接毒后96h 存活的鸡胚比60～96h 区间死亡的鸡胚胚液收获量大，可能鸡胚死亡越早，胚液收获量越小。因此，单以鸡胚液收获量指标考评，A 组、B 组和C 组的鸡胚接毒量比较合适。

2.2 鸡胚液的病毒含量各组收获的鸡胚液病毒含量测定结果见表2。

表2 鸡胚液的病毒含量

从表2 看出，生产NDV-LaSota 株抗原时，A 组和B 组收获的鸡胚液病毒含量较低，C 组、D 组和E 组收获的鸡胚液病毒含量较高，约是A 组的10 倍，但C 组、D 组和E 组之间无差异。说明鸡胚增殖NDV-LaSota 株抗原时，接毒量过小，一定时间内病毒增殖达不到高峰；当接毒量达到一定量，就能获得高病毒含量的鸡胚液，若进一步增大接毒量，不足以引起病毒更高的增殖效果，提高不了鸡胚液病毒含量。因此，单以鸡胚液病毒含量指标考评，C 组、D 组和E 组的鸡胚接毒量比较合适。

综上，在用SPF 鸡胚生产NDV-LaSota 株抗原时，接毒量以10000EID/胚为宜，这样一方面能提高所产鸡胚液的病毒含量，另一方面还能增加鸡胚液的收获量。

3 结论与讨论

畜牧养殖业的健康运营离不开疫病的防控，通过疫苗免疫接种来激发动物机体产生特异性抗体，当抗体达到一定浓度，就有了可靠的抵抗力，避免疫病的发生及流行。疫苗的质量是影响免疫效果的关键因素，疫苗生产所用的抗原含量是疫苗质量的保证。本试验探索出了SPF 鸡胚生产NDVLaSota 株抗原，合适的鸡胚接毒量为10000EID50/胚，这样既能达到一定时间内，增殖病毒所获得的鸡胚液病毒含量较大，从而保证了抗原质量，又能降低接毒鸡胚60～96h 区间的死亡率，以增大鸡胚液的收获量，降低生产成本，这与高等职业教育教材的观点“通常鸡胚发育至13～15 日龄，尿囊液含量最高”相一致。本试验只针对SPF 鸡胚增殖NDVLaSota 株抗原时的接毒量进行了探究，结果有一定的局限性，其他鸡胚增殖NDV-LaSota 株抗原或不同鸡胚增殖其他病毒的适宜接毒量方面仍有待研究。