鼠李糖乳杆菌Probio-M9的特异性荧光原位杂交探针设计及应用

徐瑞波，高广琦，白晓晔，李伟程，张和平*

（1 内蒙古农业大学 乳品生物技术与工程教育部重点实验室 呼和浩特010018 2 内蒙古农业大学 农业农村部奶制品加工重点实验室 呼和浩特010018 3 内蒙古农业大学 内蒙古乳业生物技术与工程重点实验室 呼和浩特010018）

人体肠道是大量活细菌的天然栖息地[1]，有超过500 种细菌[2]。研究证实，肠道中生长的正常微生物是肠道的生物屏障[3]。乳酸杆菌是人类结肠中的常驻菌群，是肠道中的优势细菌[4]。大多数乳酸菌具有益生功能，被归类为益生菌[5]。益生菌是一种有益于宿主的细菌，可以促进肠道菌群的生态平衡[6]，有助于增强肠道免疫功能[7]，维持肠道胆固醇平衡[7]以及减轻抗生素副作用等功效[8]。

人体摄入的益生菌通常在肠道中定植。为了检测益生菌在肠道中的存活和定植，通常使用传统识别方法和分子生物学鉴定方法。传统的识别方法[9]包括形态学识别以及生理生化识别[10]。分子生物学鉴定方法主要包括聚合酶链反应（PCR）、变性梯度凝胶电泳（DGGE）和荧光原位杂交[11]。荧光原位杂交是一种非放射性的原位杂交技术，结合了荧光显微镜、共聚焦显微镜和流式细胞仪检测方法，可以快速、准确地鉴定样品中的靶细胞。目前，荧光原位杂交技术已广泛用于靶细菌的靶标识别[12]。通过基因组测序，菌株水平特异性探针的开发可以更准确地定性检测宿主中的菌株，为益生菌的开发提供更多的研究证据。近年来，已开发出在侧链上官能化而无荧光团的D-氨基酸（DAA）的类似物（荧光D-氨基酸，FDAA），用于细菌肽聚糖的代谢标记。此外，FDAA 被用于体内微生物标记[13]，用于荧光跟踪和评估移植微生物的生存能力。

目前，本实验室已开发出几种可食用的益生菌菌株，其中鼠李糖乳杆菌Probio-M9 是从健康母乳中分离得到的[14]，具有优异的胃肠液耐受性和良好的胆汁盐耐受性，具有作为益生菌的基本条件，可以改善肠道菌群的多样性并增强免疫力。为了研究特定菌株在宿主肠中的定植和精确定位，使用荧光原位杂交定位鼠李糖乳杆菌Probio-M9。基于鼠李糖乳杆菌Probio-M9 的整个基因组序列设计了菌株特异性探针，并对该探针进行荧光原位杂交测试，以评估和验证该探针与鼠李糖乳杆菌杂交的特异性和有效性。此外，通过与FDAA 探针双重测试，在摄入鼠李糖乳杆菌Probio-M9 后大鼠的肠道内鉴定到活的鼠李糖乳杆菌Probio-M9，进而定位宿主中的益生菌。

1 材料与方法

1.1 细菌菌株的培养

本研究中使用的细菌菌株均由内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室提供，具体信息见表1。

表1 试验菌株信息Table 1 Information of main strains in the experiment

1.2 仪器与试剂

LSM 900 共焦显微镜，卡尔蔡司（上海）管理有限公司；LC-JSY-1 恒温干式金属浴高温加热振荡器，湖南力辰仪器科技有限公司。

本研究所有菌株所用培养基为MRS 培养基，购自广东环凯微生物科技有限公司；没有羧基保护基的FDAA 购自中国多肽公司（中国杭州）；带有羧基保护基的FDAA 探针是由 Scilight Biotechnology（中国北京）定制合成的。

1.3 大鼠

10 周大的Wastar SPF 雌性大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司（中国北京）。所有大鼠均在具有12 h 光照/黑暗周期的温度控制（24℃）的动物设施中饲养，并接受标准饮食，可以自由享用清洁水。每天早晨更换饲料和水以保持新鲜。每组大鼠单笼饲养。

1.4 鼠李糖乳杆菌种水平特异性探针（Probe-16S）设计

根据现有的乳杆菌的基因组信息，筛选鼠李糖乳杆菌基因组的特定片段，根据鼠李糖乳杆菌的16S 序列设计了特异性探针[15]（5’-CGCCGACAACAGTTACTCTGCCGACC-3’），并在5’端用6-羧基荧光素（6-FAM）荧光基团修饰。杂交优化后，使用鼠李糖乳杆菌的15 个代表性菌株和乳杆菌相关属的15 个代表性菌株和乳杆菌相关属的15 个代表性菌株测试了探针16S 的特异性（表1）。

1.5 鼠李糖杆菌Probio-M9 菌株水平特异性探针（Probe-SP）设计

根据现有乳酸杆菌的基因组信息，首先筛选鼠李糖乳杆菌基因组的特定片段，然后将鼠李糖乳杆菌不同菌株的基因组与Probio-M9 菌株的基因组进行比较和分析，以筛选特异性基因组片段。基于该片段，设计了Probio-M9 菌株的水平特异性探针（5'-CCAACTGACGCCTTCACTTCG）。使用鼠李糖乳杆菌的15 个代表性菌株和来自乳杆菌的相关属的15 个代表性菌株测试探针-SP 的特异性（表1）。

1.6 荧光原位杂交（FISH）方法

将要标记的细菌细胞用PBS 洗涤2 次，重悬于500 μL PBS 中，加入等体积的无水乙醇，并在-20 ℃过夜。将细菌溶液以12 000×g离心3 min，除去上清液。然后在37 ℃下用100 μL 工作液（使用Tris-HCl pH 6.5 配制质量浓度为10 mg/mL 的工作液）处理细胞10 min，离心去除上清液，用PBS洗涤，加入500 μL 杂交缓冲液以及5 μL 探针储备溶液，46 ℃摇动4 h 杂交，并通过离心除去上清液。加入500 μL 的杂交缓冲液，48 ℃摇动15 min洗涤混合物，通过离心去除上清液[16-17]。

1.7 特异性Probe-SP 探针体外试验验证

为了测试Probe-SP 在复杂样品中的杂交效果，将培养的鼠李糖乳杆菌Probio-M9 菌株与大鼠粪便混合，并分别用Probe-16S 和Probe-SP 进行FISH 测试。

1.8 特异性Probe-SP 探针体内试验验证

为了测试Probe-SP 在体内复杂环境下能否特异性杂交到Probio-M9，将12 只Wistar 大鼠分成2 组，分为鼠李糖乳杆菌Probio-M9 组和对照组（n=6）。鼠李糖杆菌Probio-M9 组每天服用Probio-M9（4×109CFU），对照组每天服用生理盐水。在灌胃第14 天，每组随机选择3 只大鼠口服FDAA。灌胃15 d 后处死大鼠，取小肠、盲肠、结肠和大鼠各部分的内容物。使用Probe-SP 对收集的肠组织和内容物进行FISH 试验。

2 结果与分析

2.1 特异性探针的荧光原位杂交试验条件优化

通过比较鼠李糖乳杆菌Probio-M9 和其它鼠李糖乳杆菌的基因组，筛选鼠李糖乳杆菌Probio-M9的特异性序列，并设计了Probe-SP。特异性探针Probe-SP 和特异性探针Probe-16S 用于与15个鼠李糖乳杆菌菌株和15 个其它乳酸杆菌菌株杂交。试验结果表明特异性探针Probe-SP 仅与鼠李糖乳杆菌Probio-M9 杂交（表1 和图1），而探针Probe-16S 可与其它鼠李糖乳杆菌杂交。特异性探针Probe-SP 和探针Probe-16S 都不能与其它乳酸杆菌菌株杂交，证明特异性探针Probe-SP 具有特异性。

图1 特异探针Probe-SP 对鼠李糖杆菌Probio-M9 的荧光显微镜结果Fig.1 Fluorescence microscopy results of L.rhamnosus Probio-M9 by specific Probe-SP

探索了一系列条件后，发现经溶菌酶处理的细胞具有更好的杂交效果，最佳杂交条件为46 ℃处理4 h。

2.2 特异性Probe-SP 探针体外试验验证结果

在大鼠粪便中观察到特异性的培养鼠李糖乳杆菌Probio-M9 菌株杂交（图2），表明Probe-SP适用于检测和定量复杂样品中的乳酸杆菌物种。

图2 特异探针Probe-SP 对鼠李糖杆菌Probio-M9在大鼠粪便中的荧光显微镜结果Fig.2 Fluorescence microscopy results of L.rhamnosus Probio-M9 by specific Probe-SP in rat feces

2.3 特异性Probe-SP 探针体内试验验证结果

从图3 和4 中可以看出，绿色荧光标记代表鼠李糖乳杆菌Probio-M9，红色荧光标记代表活菌，红色和绿色荧光标记代表鼠李糖乳杆菌M9，结果表明，该方法可以鉴别复杂样品中的鼠李糖乳杆菌Probio-M9，为今后益生菌在肠道菌落的研究提供了一定的理论基础。

图3 特异探针Probe-SP 和FDAA 探针对鼠李糖杆菌Probio-M9 在大鼠小肠内容物中的荧光显微镜结果Fig.3 Fluorescence microscopy results of L.rhamnosus Probio-M9 by specific Probe-SP and FDAA Probe in rat small intestine contents

图4 特异探针Probe-SP 和FDAA 探针对鼠李糖杆菌Probio-M9 在大鼠盲肠内容物中的荧光显微镜结果Fig.4 Fluorescence microscopy results of L.rhamnosus Probio-M9 by specific Probe-SP and FDAA Probe in rat cecum contents

3 结论

本研究针对鼠李糖乳杆菌Probio-M9 和其它相关物种的基因组序列，分别设计了种水平特异性探针（Probe-16S）和菌株水平特异性荧光原位杂交探针（Probe-SP），并通过对15 株鼠李糖乳杆菌菌株和15 株其它益生菌进行探针特异性的验证；同时结合荧光D-氨基酸（FDAA）代谢探针，在大鼠的肠道中检测到鼠李糖乳杆菌Probio-M9 的活细胞。本方法在在摄入鼠李糖乳杆菌Probio-M9菌株后可利用该探针检测及定位宿主肠道内的鼠李糖乳杆菌Probio-M9，为以后开发和利用Probio-M9 提供更多的理论依据。