受体酪氨酸激酶Axl及其配体Gas6与肝细胞癌的关系

吴 雨，钱平安，范兴良，祝峻峰

上海中医药大学附属市中医医院 肝病科，上海 201203

肝细胞癌(HCC)是目前我国常见的恶性肿瘤之一，因其发病隐匿、发病率高、死亡率高、复发率高，被公认为重大疑难疾病[1]。在肝癌进展中，上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在转移的早期阶段起关键作用。EMT赋予细胞转移和入侵的能力，包括干细胞特征、减少凋亡，促进免疫抑制，不仅在发育过程中起着关键的作用，并且参与癌症的发生过程。受体酪氨酸激酶Axl与EMT密切相关，直接影响间质状态并赋予其侵略性表型，在EMT介导的致癌过程中发挥关键作用，抑制Axl可逆转EMT。在肝癌细胞发生EMT过程中，Axl结合支架蛋白14-3-3ζ是TGFβ1介导HCC发生发展的必要条件[2]。故靶向抑制Axl成为肿瘤治疗的新策略[3]。

1 Gas6/Axl在肝脏中的生物学特性

1.1 受体与配体 Axl是一种酪氨酸激酶受体(receptor tyrosine kinases，RTK)，属于肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophage,TAM)家族，由Tyro-3、Axl和Mer组成。TAM受体包含两个免疫球蛋白样(Ig)结构域，其胞外结构域中包含两个纤连蛋白3型(FNⅢ)部分，激酶结构域中包含保守氨基酸序列KW(I/L)A(I/L)ES[4]。人类Axl基因位于染色体19q13.2上，由20个外显子编码，形成由894个氨基酸组成的蛋白质。Axl被翻译后糖基化形成120 kD(部分糖基化形式)或140 kD的蛋白质。Gas6和ProS是TAM的配体，其中Gas6与Axl的亲和力最高，而ProS主要与Tyro3和Mer结合Axl通过维生素K翻译修饰后具有生物活性[5]。

Gas6介导的Axl二聚化分两步进行，首先Axl免疫球蛋白样结构域与Gas6的层状蛋白G样结构域结合，使得Gas6与Axl以1∶1的比例连接，形成高亲和力的Gas6/Axl复合物，而后这种复合物横向扩散，形成Axl同源二聚体化复合物[6]。Axl可介导细胞增殖，依赖于MAPK/ ERK途径，并涉及PI3K和c-Jun-N-JNK的激活。Ras、Twist和NF-κB是Axl的下游靶标[7]。微环境因素(例如缺氧)激活Axl信号转导以驱动血管生成[8]。缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factors，HIF)-1和HIF-2可结合到小鼠体内Axl近端启动子的缺氧反应元件上，导致HCC中Axl的转录激活[9]。Axl的另一个上游调节剂是RAB10，在HCC患者中其与肿瘤大小和晚期肿瘤的分期有关[10]。在HCC进展中，Axl由Hippo/YAP信号上调和诱导，增强了肝肿瘤的侵袭和淋巴转移作用[11]。

1.2 Gas6/Axl在HCC中的作用 Axl信号转导异常会引起炎症、自身免疫性疾病和癌症[6]。Gas6/Axl信号转导通路有助于肿瘤细胞在凋亡刺激的应答中存活[6,12]。Axl及配体Gas6浸润在由肿瘤细胞、脉管系统、白细胞和骨髓祖细胞组成的肿瘤微环境中[13]。在HCC中，Gas6/Axl信号通路可通过激活slug促进肿瘤侵袭[14]。同时，Axl也是EMT和化学抗性的关键调节剂[15]。在HCC中，由于TGFβ的协同作用，肝肿瘤细胞经历EMT、Axl信号转导，最终导致肿瘤细胞侵袭/转移[2]。在这个过程中，Gas6/Axl与支架蛋白14-3-3ζ结合后激活JNK，JNK通过Smad3接头区域的异常磷酸化和促转移转录，将TGFβ转换为肿瘤进展功能基因。

2 Gas6/Axl信号通路与HCC的EMT过程

2.1 EMT与HCC EMT是指上皮细胞在特定的生理或病理条件下失去上皮特性，获得间质细胞表型的一种生物现象。主要表现为细胞迁移性和侵袭性、诱导干细胞特性等。EMT是可逆的，其反向过程被称为MET[16]。根据组织环境或激活信号，在EMT的过程中，上皮细胞可能失去部分特征，存在中间状态(EMTed)，具有上皮和间充质表型的属性，并且还表现出干细胞样的特性，显示出高度的可塑性，并在癌症发生发展中起关键作用[17]。肿瘤内存在自我更新的干细胞样细胞，称为“肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSCs)” ，EMT过程使癌细胞在肿瘤发展过程中扩散和自我更新，分化的癌细胞向肿瘤干细胞转变，并产生致癌突变，通过EMT过程整合到肿瘤干细胞中[18]。在许多类型的癌症中，干细胞已经通过表观遗传程序与EMT表型联系起来。同样，HCC中也出现具有EMT/MET类型的肿瘤干细胞。在肿瘤侵袭前的HCC患者样本中，观察到具有间充质表型的干细胞[19]。有研究[20]用免疫组化法检测27例HCC患者上皮细胞和肿瘤干细胞标志物的表达，发现63%的患者上皮细胞标志物E-钙黏蛋白表达下调，81%的患者上皮细胞标志物N-钙黏蛋白表达上调，78%的患者CSC标记CD13上调，表明EMT可以促进HCC的侵袭和转移，并与HCC的预后和治疗有着密切的关系[21]。

2.2 Axl与HCC的EMT过程 大多数肿瘤靶向治疗是通过抑制RTK或其下游信号转导途径来抑制细胞的生长和侵袭[22]。Axl是属于RTK家族的跨膜糖蛋白，最初从慢性髓细胞白血病患者中分离得到。正常生理条件下，Axl表达于包括大脑在内的各种器官中，参与间质细胞和神经系统发育[23]。而在肿瘤进程中，Axl的过表达与肿瘤患者的生存率相关，可在多种类型的癌症中检测到[4]。已发现Axl的过表达与多种癌细胞的侵袭和转移密切相关[24]。癌症中的Axl信号参与上皮细胞真核转化[25]，其中极化的上皮细胞失去其连接完整性，变成能动的、侵袭性的间充质细胞[26]。在643种人类癌细胞系中，检测到Axl表达升高与间充质表型呈正相关[27]。

在EMT的过程中，Axl是EMT的重要下游调节剂，是许多恶性肿瘤转移扩散的必需条件[25,28]。而在HCC的EMT过程中，Axl是肿瘤侵袭的决定因素[2,14]，在这个过程中，基因表达主要受转录因子Slug调控，Snail和Twist赋予肿瘤细胞运动性，并通过E-cadherin抑制及Vimentin过表达达到侵袭和转移的目的[29]。敲除Axl可导致间充质HCC细胞丧失侵袭和内皮迁移的能力，以及上皮性HCC细胞失去由于Axl过表达诱导的转移能力[2]。HCC细胞的局部浸润和肝内转移与EMT相关，TGFβ在早期肿瘤发展过程中具有抑制肿瘤的作用，但在晚期，肝肿瘤细胞可通过拮抗细胞生长抑制作用和细胞毒性作用诱导EMT，激活晚期HCC中TGFβ信号转导，导致HCC的进一步发展[30]。Reichl等[2]发现Axl信号是TGFβ介导HCC进展的关键，Axl信号导致Smad3L的异常磷酸化、前转移靶基因的诱导以及TGFβ的分泌增加，进而激活TGFβ的促肿瘤靶基因、纤溶酶原激活物抑制剂1、基质金属蛋白酶(MMP)9和Snail。

2.3 Gas6/Axl信号通路与HCC的EMT过程 Axl的致癌潜能在酪氨酸激酶域内，可通过结合配体Gas6，激活其酪氨酸激酶活性，进而活化下游的信号转导通路，在细胞的增殖、黏附和转化过程中发挥重要作用[31]。此过程中Gas6/Axl信号转导必须与14-3-3ζ结合，并作用于下游信号。14-3-3ζ蛋白参与各种细胞过程的信号成分结合[32]，其与靶标之间的相互作用主要由结合蛋白的磷酸化介导。在HCC中，可观察到14-3-3ζ的过表达[33]，14-3-3ζ在复合αB-晶状体蛋白中诱导HCC细胞的EMT发生[34]。14-3-3ζ充当Gas6/Axl信号转导的支架蛋白，siRNA对14-3-3ζ的干扰减弱了间充质3sp细胞以及过表达Axl的3sp细胞中Gas6/Axl依赖性的迁移和侵袭反应，表明Axl必须与14-3-3ζ相互结合激活下游信号[2]。由Gas6/Axl激活的下游途径包括PI3K/Akt途径[35]、MAPK/ERK途径[36]和Ral GTPase蛋白途径[37]。

在HCC的EMT过程中，有多条信号通路起作用，包括RTK通路、TGFβ通路Wnt通路以及Hedgehog通路等。TGFβ通路被认为是参与EMT过程中最具影响力的信号通路。典型的TGFβ信号通路被激活后，三个亚型之一(TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3)与TGFβ受体Ⅱ(TGFβRⅡ)结合，激活TGFβ受体Ⅰ，形成TGFβRⅡ/Ⅰ异源二聚体，进一步启动下游多个信号通路，包括依赖Smads的通路和非依赖Smads的通路。在肿瘤环境下，依赖Smads通路调节EMT相关的转录因子，主要包括Snail、Slug、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、Twist等，通过促进肿瘤血管生成、免疫抑制及EMT的发生等，增强肿瘤的侵袭和转移能力。当HCC进展中发生EMT时，Gas6/Axl/14-3-3ζ信号激活JNK，磷酸化TGFβ通路中Smad3连接区的丝氨酸-123残基，促进TGFβ靶基因如PA1、MMP9和Slug的上调，以及间充质HCC细胞中TGFβ1分泌的增加，导致间充质HCC的侵袭性表型增强[2]。敲除Axl或14-3-3ζ可消除Smad3L磷酸化的影响。

3 Axl在HCC诊断中的应用

早期HCC的准确检测和鉴别诊断可以显著提高患者的生存率，目前在临床实践中HCC的检测主要通过诊断成像技术和血清生物标志物的测定，代表的血清标志物是AFP。然而在HCC的早期阶段，AFP的灵敏度仅为18%～60%，特异度有限。因此，一些其他的生物标记已被用来补充和增加HCC检测的准确性，其中最常用的是去-γ-羧基凝血酶原、AFP-L3、骨桥蛋白、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3和高尔基蛋白-73[38]。但关于这些标志物性能的报道是相互矛盾的，Meta分析[39]显示，去-γ-羧基凝血酶原和AFP-L3的表现都不如AFP。

Axl通过其配体Gas6与胞外结构域的结合被激活，导致下游靶标的磷酸化，胞外结构域可被MMP处理，释放出一种可在血清中检测到的80 kD可溶性蛋白(sAxl)[40]。因此在一项涉及中国和欧洲患者的多中心研究[41]中，讨论了sAxl作为HCC非侵入性生物标志物的潜力，对311例HCC患者的血清进行了分析。根据BCLC标准，将患者分为极早期、早期和晚期HCC。与健康或肝硬化对照者相比，在所有的HCC患者 (18.575 ng/ml)、极早期的HCC患者(18.064 ng/ml)和早期的HCC患者 (16.430 ng/ml)中发现了显著增加的sAxl水平，在HCC晚期，观察到sAxl水平进一步上升(18.880 ng/ml)，表明在各期HCC患者血清中均可检测到sAxl的水平明显增加。并且在极早期的AFP阴性患者中，sAxl显示出更高的灵敏度(80%)和特异度(69.2%)。在HCC与肝硬化的鉴别诊断中，sAxl (AUC=0.815)也优于AFP (AUC=0.771)，并且与AFP (55.3%)相比显示出更高的敏感度(78%)。在患有乳腺癌、卵巢癌或结肠直肠癌的患者中，sAxl水平并没有变化，从而证明了sAxl作为HCC生物标志物的特定作用。结肠癌的肝转移不会改变sAxl的血清水平，因此可以区分HCC和继发性的肝脏恶性肿瘤。总之，与单用AFP相比，sAxl在检测HCC的早期阶段显示出了较高的灵敏度。sAxl和AFP的结合进一步提高了诊断效率，并在HCC和肝硬化的鉴别诊断中显示出较高的准确性。此外，sAxl在AFP阴性的HCC患者中表现良好。因此sAxl是筛选早期HCC的潜力候选生物标志物之一。

4 Axl及其抑制剂在HCC治疗中的应用

Axl与多种恶性肿瘤分子靶向治疗获得性耐药的发展有关，也是抗血管生成药和多靶点激酶抑制剂适应性耐药的关键[42]。Axl及其主要配体Gas6在许多人类癌症(如肺癌、乳腺癌和胰腺癌)中过度表达和活化，并与不良预后、促进侵袭性/转移、EMT表型和耐药性相关。在不同的模型系统中单独或与其他药物联合，使用特定的小分子激酶抑制剂或抗体来靶向Axl，可导致Axl介导的信号通路失活，重新获得药物敏感性和提高治疗效果，因此将Axl定义为癌症治疗的有希望的新靶点。Pinato等[43]使用R428测试了Axl抑制的细胞毒性潜力，R428是一种Axl特异性小分子抑制剂，在体内外均具有抗肿瘤功效。使用SRB分析，证实在连续暴露于药物72 h后，R428在一组HCC细胞系的微摩尔范围内发挥生长抑制作用。由于R428是一种选择性的具有Axl抑制特性的酪氨酸激酶抑制剂，利用细胞增殖、运动和侵袭能力等实验表明，通过基因下调和R428的药理学抑制，对Axl进行治疗性调节，可影响HCC的进展。越来越多的证据表明，Axl是多靶点酪氨酸激酶抑制剂的主要调节因子，推测Axl磷酸化可能在机制上参与了索拉非尼耐药性的发生。R428对索拉非尼具有诱导生长抑制和促凋亡潜能的增量效应，使得Axl抑制剂在晚期HCC一线治疗上具有一定的开发前景，在患者因肝功能障碍或症状性进展而面临无法治疗之前，延长无进展生存期。

5 展望

在HCC中，Gas6/Axl轴过度表达/过度激活可导致其进展，包括影响侵袭、转移、化疗以及靶向抗癌的治疗，表明Gas6/Axl通路是潜在的癌症治疗靶点。对于这条通路的抑制可以通过多种方式实现，例如使用Axl酪氨酸激酶抑制剂、靶向Axl/MET/EGFR界面的药物及其下游信号效应子，或者通过使用针对Gas6和Axl的阻断抗体。已有多家药物公司正在进行多种抑制剂的临床开发，这些抑制剂或是专门针对Axl，或者是针对Axl的具有良好效力的多靶点激酶抑制剂[44]。

Axl在HCC诊断中的前景，体现在其释放的可溶性蛋白sAxl可作为HCC早期诊断的标志物。sAxl的水平反应肝脏疾病的进展过程，对患者进行分层，利于HCC和肝硬化的鉴别，表明Axl和sAxl有作为精确诊断HCC标志物的潜力。在HCC发生发展过程中，EMT促进HCC的侵袭和转移，而Axl作为EMT的重要下游调节剂，是肿瘤侵袭的决定性因素。目前对于Axl活化在HCC发生、侵袭、转移和耐药性等多个方面的研究取得了一些进展。但仍需解决一些问题，如Axl抑制在阻断肿瘤转移、侵袭和逆转耐药性的作用之外如何影响癌症免疫？Axl/Gas6抑制剂通过什么机制发挥抗癌作用？由于Axl在癌症发生、侵袭/转移/EMT和耐药性等背景中的作用，在临床研究中，需要结合特定情况，仔细评估这些因素。随着对Gas6/Axl信号通路研究的不断深入，其可为HCC的早期诊断和治疗提供新的思路，而其在肿瘤EMT中的作用机制和对基因表达的调控，不仅为抗HCC治疗提供新的研究方向，也可推及至其他类型的肿瘤，为进一步研究肿瘤侵袭和转移的机制奠定基础。

作者贡献声明：吴雨拟定写作思路，撰写论文及修改；钱平安、范兴良参与资料收集；祝峻峰指导文章修改。