急性肝衰竭动物模型的研究进展

龙富立，林 镛，彭子明，冯 逢，张建玲，毛德文，韦艾凌,3

1 广西中医药大学研究生学院，南宁 530200； 2 广西中医药大学第一附属医院 肝病科，南宁 530023； 3 广西中医药大学成人教育学院，南宁 530001

急性肝衰竭(acute liver failure，ALF)是由多种原因引起的肝细胞大量坏死，肝功能严重障碍，以其病情进展迅速、恶化严重及高病死率为显著特征，为患者和社会带来严重负担[1]。治疗上肝移植能有效降低患者病死率，但由于费用高昂和肝源缺乏，仍以内科及人工肝为优先选择，但病死率居高不下。迄今为止，对于ALF的发病机制尚未明确，而符合ALF表现的高质量动物模型仍然缺乏，想要深入了解ALF发病机制、探求更加有效的治疗方式、提高患者生活质量，制备与临床发病相似并可复制的动物模型尤为重要。

1 实验动物

1.1 啮齿动物 啮齿动物在ALF造模中最为广泛，大鼠品系一般以 Wistar 和 SD 为主，小鼠以 ICR、C57BL/6J、KM在研究实验中最为常见，也有其它品系鼠类在研究中出现，可以看出ALF造模对鼠类品系无严格要求。

1.2 兔、猪、犬 兔、猪、犬制备有手术和药物两种造模方式，因中大型动物手术对体内观察情况较为直观，是研究肝胆外科疾病良好的动物模型，其手术模型多用于试验新型人工肝支持系统，化学药物模型常用于研究ALF发病机制和组织病理变化等。

1.3 非人灵长类 研究[2]表明，非人灵长类动物肝脏发育和内环境变化与人类极其相似，其模型在临床上与 ALF 患者的临床特征、肝脏指标、组织病理学和寿命等表现出相似的变化，常用于深入研究ALF发生的潜在机制及新型病毒基因型试验研究[3]。

2 造模方法

常见的ALF造模方法有化学或药物、手术、手术结合药物、感染等。化学药物建模包括D-氨基半乳糖胺(D-galactosamine，D-GalN)、脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)、硫代乙酰胺( thioacetamide，TAA)、对乙酰氨基酚 (acetaminophen，APAP)、四氯化碳 (carbon tetrachloride，CCl4)、刀豆球蛋白A(CONA)、卡介苗、鹅膏蕈碱等。手术建模包括肝缺血模型和肝切除(次/全)模型。不同的建模方法涉及不同的实验流程，每种动物模型各有优势，但同时存在一定的不足。

2.1 化学或药物模型

2.1.1 对乙酰氨基酚(APAP)

2.1.1.1 原理 APAP通过诱导细胞氧化应激增强、线粒体功能障碍导致肝细胞坏死，而其中线粒体功能障碍是APAP诱导 ALF 模型成功的主要机制，其通过抑制线粒体 ATP 酶活性，并对线粒体超微结构造成损伤[4]。

2.1.1.2 造模方法 (1)啮齿动物：以750 mg/kg APAP腹腔注射小鼠，12 h后肝脏病理符合临床ALF特征表现，提示造模完成[5]。(2)犬类：Ortega等[6]方法为在动物禁食12 h后，以500 mg/kg APAP每90 min静脉注射，此方法48 h后肝脏典型病理为Ⅲ区呈肝小静脉汇合性坏死，76 h内动物全部死亡，且具有临床ALF生化和形态学特征。(3)猪类：Dargue等[7]予250 mg/kg APAP经猪十二指肠给药，并使用0.5～4 g/h的维持量将血清APAP浓度维持在300 mg/L以上，造模成功指标为凝血酶原时间>3 s，模型病理呈现肝小叶到中部肝细胞变性坏死，血清指标与临床APAP诱导的ALF相似，包括肝性脑病的迹象。

2.1.2 D-氨基半乳糖胺(D-GalN)

2.1.2.1 原理 D-GalN可快速消耗体内尿苷酸，使细胞器和酶的生成补充障碍，导致肝细胞出现不可逆的损伤。LPS能刺激肝脏巨噬细胞、Kupffer细胞等产生TNFα，破坏血管内皮的完整性，使肝细胞坏死[8]。而D-GalN又能加强LPS的急性毒性，所以D-GalN的单一用药和D-GalN配合LPS使用均可诱导ALF模型。

2.1.2.2 造模方法 (1)D-GalN/LPS：①小鼠。吴小红等[9]腹腔注射200 μl LPS (2.5 mg/kg) /D-GalN (0.3 g/kg)的生理盐水溶液一次成膜，小鼠存活时间为8～12 h。②大鼠。龙富立等[10]予D-GalN(600 mg/kg)联合LPS(20 μg/kg)腹腔注射大鼠一次成模，造模时间为48 h；Kitazawa等[11]腹腔注射 D-GalN(500 mg/kg)/LPS(50 μg/kg)3 h 后，可达到ALF水平。③猪类。彭承宏等[12]经门静脉注射0.5 g/kg D-Ga lN和1 μg/kg LPS的方法建立ALF模型，约48 h造模完成，肝脏病理可见肝细胞坏死伴出血，7 d病死率为83%，造模后表现及生化指标皆与临床相似，可辅助部分原位肝移植治疗ALF的研究。(2)D-GalN：①大鼠。Zhang团队[13]经过实验后证实1.4 g/kg D-GalN剂量制备的大鼠ALF模型在血清组织学、临床表现等方面与人类相似。②猪类。Zhang等[14]通过分离颈静脉后行中央静脉导管给药，D-GalN剂量为1.2 g/kg，模型在24 h各血清和炎症指标升高，48 h后成膜，其病理表现为肝小叶结构异常，Disse腔明显扩张，并有肝细胞溶解性坏死和碎片样坏死，模型动物死亡约72 h。③犬类。Patzer等[15]使用异氟醚麻醉后经静脉注射1.5 g/kg D-GalN，血清指标在16 h明显上升而核苷酸、氨、胆红素含量则在32 h出现高峰，模型平均生存时间 43.7 h。④非人灵长类。Feng等[16]以小隐静脉穿刺代替血管插管，注射2.5 g/kg D-GalN可诱导ALF模型，模型在5 d内全部死亡，病理显示在坏死区域有肝细胞弥漫性肿胀，并伴有细胞变性；肝酶、TBil、炎症指标及内毒素水平均符合临床ALF表现，也存在治疗窗口期。

2.1.3 硫代乙酰胺(TAA)

2.1.3.1 原理 TAA首先是使细胞氧化应激增加，促使氧化产物的积累，出现细胞坏死和肝损伤；其次是释放促炎性介质引起炎症传播,使肝损伤进一步加重[17]。

2.1.3.2 造模方法 (1)小鼠。杨天翼[18]予200 mmg/kg TAA腹腔注射小鼠，一次成膜，小鼠病理血清、病死率均与临床相似，但伴有明显肠道损伤；(2)大鼠。毛德文等[19]采用10%TAA溶液6 ml/kg皮下注射，24 h后重复注射同等剂量，48 h可造模成功；张美华等[20]予不同剂量TAA研究药物量效关系,发现250 mg/kg、350 mg/kg组肝性脑病发生率100 %。TAA为制备ALF常见药物，腹腔注射建模剂量尚未统一，100 mg /kg、400 mg/kg、600 mg/kg等也均有报道，制备方式也均无小特殊，注意结合体质量及次数即可。

2.1.4 四氯化碳(CCl4)

虽然福州城市林业在数量指标上较高，但各区域在城市森林的均匀度方面差异还是比较大的，台江是老城区，人口、建筑相对比较密集，城市绿地的比例相对较小，而仓山区、晋安区、马尾区有严格的绿地规划，其绿化覆盖率与绿地率与人均公园绿地面积远远高于台江区，鼓楼区虽然人口密集、建筑物较多，但区内有西湖公园、左海公园、温泉公园等市级公园，故福州鼓楼区市民对其绿地感知差异不大，台江区内绿地数量明显不足，故台江区市民在城市森林覆盖率、均匀度、满足精神需要等方面感知与其它各区域有显著差异。

2.1.4.1 原理 CCl4进入机体经细胞色素P450激活后攻击细胞膜上的磷脂分子，并与肝细胞膜脂质和蛋白质共价结合，破坏肝细胞膜结构和功能，影响蛋白质代谢和Ca2+内流增加，引起肝损伤及生化血液学的改变[21]。

2.1.4.2 造模方式 CCl4制备ALF模型有多种方式，而灌胃法CCl4直接经门静脉作用于肝脏，建模以此法较为多见。(1)啮齿动物。王欢等[22]以4 ml/kg的CCl4灌胃可诱导大鼠ALF模型；(2)猪类。Nardo等[23]以450 mg/kg剂量CCl4制备ALF模型研究体外门静脉氧合作用，模型7 d病死率为100%，肝组织显示60%～70%肝坏死；(3)犬类。采用CCl4联合APAP，第1次予30%APAP(0.5 ml/kg)静脉注射和40%CCl4(0.5 ml/kg)腹腔注射，12 h后重复给药，剂量为第1次的1/2，可建立犬ALF模型。24 h病死率为0，76 h为90%，病理出现以中心静脉为中心的大片坏死，坏死区充血及炎症细胞侵润等，肝损伤在24 h达到高峰[24]。(4)CCl4联合LPS。前12 周连续腹腔注射 20% CCl4油溶液 5 ml /kg，每周 2 次，制备小鼠慢性肝损伤模型，12周+3 d后腹腔联合注射 1 g/kg D-GalN 和 10 μg/kg LPS 制备ALF模型[25]。

2.1.5 刀豆球蛋白A(Con A)

2.1.5.1 原理 Con A激活T淋巴细胞使动物肝实质大量淋巴细胞浸润(CD4+T、TNFα、IL-6为主)，导致肝组织坏死，门静脉充血等特异性肝损伤[26]。此方法能较好地模拟人类病毒性肝炎、免疫性肝病等。

2.1.5.2 造模方法 高钰迪等[27]通过小鼠尾静脉注射20 mg/kg ConA约12 h建立ALF模型，总生存率为40%,病理呈现肝组织呈大块坏死，肝细胞肿胀及大量炎症细胞浸润，转氨酶、caspase-3、炎症因子等均与临床ALF相似；Li等[28]和朱鏐娈等[29]在研究中12 mg/kg和15 mg/kg ConA建立的模型也符合ALF临床表现症状。ConA作为新近ALF造模药物，建模动物选择大都为小鼠，最佳剂量尚有待统一。

2.1.6 卡介苗

2.1.6.2 造模方法 Yang等[31]通过小鼠实验报道，先经鼠尾静脉注射卡介苗 2.5 mg/只，10 d后注射LPS 10 μg/只，可成功诱导小鼠急性肝损伤模型。

2.1.7 鹅膏蕈碱 Ishiguro等[32]以猪为实验对象，采用Amanitin提取物α-氨基丁酸联合LPS的方式成功建立ALF参考模型。Zhou等[2]以猕猴采用Amanitin结合内毒素建立ALF模型，在临床表现、血清病理学等方面均与人类相似。

2.2 ALF手术模型

2.2.1 肝切除模型 (1)全肝切除模型：Filipponi等[33]手术方法为腹正中切口或右上腹肋缘斜切口进腹，先切断肝周韧带，然后整块肝切除并行门-腔静脉重新移植和门-腔分流。术中输液以维持血流动力学稳定，术后予抗生素预防感染。从手术开始监测动物生命体征、颅内压，按时段抽血观察相关指标以检测最佳ALF模型。Knubben等[34]对手术进行改进，方法是先植入Y形旁路行门-腔静脉端侧吻合及胸腔内腔静脉吻合，然后进行肝切除术，其优势在于不需要体外通道液体支持。全肝切除模型与ALF总体相似性不高，而且实验结果的重现性、可逆性及应用均起到限制，现临床使用不多。(2)部分肝切除模型：在手术方法上与全肝切除相类似，切除肝脏体积的70%～90%。Skawran等[35]手术切除猪70%的肝脏，并结合内毒素(400 μg/kg)构建ALF模型。Hung等[36]以兔为对象，摘除74%肝脏(三叶肝)后又结扎右外肝的肝蒂，适用于人工肝系统研究。Chen等[37]切除犬80%的肝脏制备ALF模型用以研究生物肝系统。占敏[38]、陈勇等[39]在切除85%、90%大鼠肝脏后可建立ALF模型。也有学者联合药物方法建模成功，曹友德等[40]报道的方法是一次性腹腔注射1000 mg/kg D-GalN和100 μg/kg LPS，同时加用乳果糖，3 h后使用戊巴比妥麻醉动物，随后结扎切除肝左叶、右叶及尾叶共 50%肝组织，血清学表现与临床相似，有较好的治疗窗口期。

2.2.2 急性肝缺血模型 第一步，门-腔静脉分流。开腹后分离门静脉和下腔静脉，再行端侧吻合或侧侧吻合。第二步，肝动脉等肝血管阻断。分流术后行肝动脉结扎，多数情况下为了保证不会出现新的侧支循坏，常把胆总管、侧支肝血管一并结扎[41]。也有报导联合其他方法进行造模：Yuasa等[42]应用腹腔镜在切除肝动脉后，通过门静脉注射7.5 ml CCl4，结合门静脉缺血诱导ALF模型，治疗窗口为6.4 h。实验能制备出较符合临床的ALF模型，手术可逆性、重复性等较肝切除模型良好，但由于阻断血流原因，其评估肝性脑病等神经系统变化方面存在不足。

2.3 感染模型 Tunon等[43]肌肉注射兔出血症病毒(rabbit hemorrhagic diseaqse virus, RHDV)分离株2×104血凝单位，85%的兔子在36～54 h内死亡，36 h后兔模型出现血清组织学、脑部神经变化均符合临床ALF症状。Crespo等[44]以同样的方式进行研究，发现ALF模型的病毒复制和诱导的炎症过程存在平行关系，而褪黑素可以通过抑制细胞自噬来降低RHDV RNA的复制发挥保护作用。

2.4 其他模型 Yamauchi等[45]注射人单克隆抗体(MoAb)诱发小鼠急性肝损伤，结果显示，MoAb 与小鼠肝细胞发生交叉反应，并在肝细胞膜上识别出一个190 kD分子。模型在注射8 h后，血清组织学符合ALF表现。此方式证明注射自身抗体的方式也可诱发自身免疫性肝炎诱导急性肝损伤。

3 ALF模型评价

按照Terblanche和Hickman[46]提出的ALF理想动物模型应含有以下特点：有可逆性；模型有重复性；动物死于ALF；有适当治疗窗口期；大型动物监测和建立体外循坏，指导临床应用和效果评价；对环境、实验人员危害最小。2000年Fourneau等[47]和Newsome等[48]作了三点补充：动物须有意识，可评估肝性脑病；生理代谢与人相似；符合伦理道德。然而就目前研究情况，尚未有满足上述情况的ALF动物模型报道，现就以所查文献结合上述评价标准做简单评价。

通过上述造模方式可以看出啮齿类药物性ALF模型大都具有可逆性、重复性、动物死于ALF、有窗口期等标准，实验具有重现性高、费用低等优势，能很好的重现临床相似的ALF症状，但生理代谢方面与人存在明显的差异，行为意识上难以把握，在评估神经系统疾病上存在不足，所以该动物模型常用于内科对中西药物机理和ALF发病机制的探讨；啮齿类动物手术模型对实验要求严格，术中并发情况多，可逆性、重复性不高，手术建模尚不常用。兔、犬、猪药物模型相比于啮齿动物与人生理代谢相似度更高，具有一定神经系统表现指标、治疗窗口期等优势，但其价格和建模方法较啮齿动物严格，兔、犬、猪手术模型可连续监测和建立体外循坏，常用于检验新型生物人工肝。RHDV感染兔模型能重现ALF相关特征，但兔与人类结构存在较大差异，其代表性仍有待商榷。从建模药物上看，药物模型以 D-GalN联合LPS和CCl4最为常见，原因是其造模原理与临床ALF发病机制相似，而且动物成模用时较短，易行性、重复性较高；手术模型上部分肝切除和肝缺血造模能重现较好的ALF症状，主要用于新型人工肝试验。随着科学技术的发展，手术结合药物造模、ConA造模、Moab造模等新型方式不断出现，研究人员可根据不同研究目的，选择合适的建模方法。

4 展望与小结

目前，ALF的发病机制尚未完全明晰，给患者和社会带来巨大的经济负担，建立良好的ALF动物模型对于发病机制和治疗策略具有重要意义。但又因为人体与动物在结构上的本质区别，患病后药物药理作用、机体内环境变化、人文心理变化等方面有较大差别，对高质量动物模型带来巨大的困难和挑战。比如多种动物在神经系统方面无法很好观察到符合人类的肝性脑病症状；同一方法在不同品种动物中所需的药物剂量尚不统一；量效关系未明确等。综上所述，制备一个高质量且可复制动物模型既必不可少，又充满艰辛，需要在研究中开拓新思路、新方法，如采取现有多种造模方法联合，取长补短；从基因组学、代谢组学、免疫组学模拟人体系统进行不断尝试；采用患者血清改造为造模药物等。

作者贡献声明：龙富立、林镛负责课题设计，资料分析，撰写论文；彭子明、冯逢、张建玲参与收集数据，修改论文；毛德文、韦艾凌负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。