内蒙古绒山羊JAG1生物信息学及表达模式分析

勿都巴拉 吴江鸿 丽 春 胡斯乐 高树新

(内蒙古民族大学 动物科技学院，内蒙古 通辽 028000)

内蒙古绒山羊是经过常年人工选育形成的地方品种，其毛被洁白并有光泽，粗毛和绒纤维混合生长，多数绒山羊毛比绒长，是我国特有优质种质资源[1]。环境和绒山羊自身因素均影响着羊绒的生长与脱落。除以上因素的影响外山羊绒的生长主要受到光周期的影响，日照由长变短时即夏至左右开始启动毛囊发育分子，使毛囊发育并绒毛开始生长[2]。绒山羊毛囊发育和绒毛生长需要多个基因和信号通路参与，其中Notch是重要信号通路之一。多项研究表明毛囊发育与Notch信号通路的参与密切相关，其可调节毛囊细胞的生长和分化过程[3-4]。

JAG1(Jagged1)基因是Notch信号通路配体之一，可与 Notch 受体细胞外结构域结合而活化Notch信号通路，激活靶基因，参与细胞增殖、凋亡和转移等生物学过程[5-6]。另外，JAG1是β-catenin/Lef/Tcf复合物的靶基因，β-Catenin诱导JAG1的转录而激活Notch信号通路[7]。研究发现，Notch受体及配体在人[8-9]和小鼠[10-11]表皮中表达，JAG1在小鼠毛囊的休止期表达，到毛囊生长期表达增强[7]。小鼠皮肤中JAG1基因缺失会阻断Notch信号通路，从而抑制毛囊生长周期，并导致毛囊转变为囊肿细胞；如果JAG1过表达，表皮中Notch的激活会引起毛囊基部扩张、皮脂腺增大和毛囊异常聚集[7,12]。最近研究发现，小鼠毛囊休止期有高度活性的调节性T细胞在皮肤中积累，调节性T细胞诱导Notch配体JAG1的表达，通过JAG1表达来促进毛囊干细胞的活性，从而毛囊逐渐进入生长期。此外，调节性T细胞中缺失JAG1会导致关键的表皮分化基因Bgn、Ccnd1、Gdf10、Sox4、Sox7和Timp3的表达显著降低[13]。近年来，JAG1的研究除了毛囊发育以外，与肿瘤发生相关报道也常见。Liu等[14]研究发现，人卵巢癌细胞中JAG1高表达，敲除JAG1可以抑制GATA1(JAG1转录因子)诱导的Notch激活和细胞增殖，从而显著抑制卵巢癌发展。小鼠JAG1通过抑制肿瘤抑制因子LKAB1表达而导致胰腺肿瘤，而JAG1的缺失促进从恶性肿瘤到良性囊性病变，因此，JAG1是肿瘤促进因子[15]。综上，关于JAG1研究主要集中在人和小鼠毛囊发育、肿瘤发生和发展等方面，JAG1是否能在绒山羊毛囊中表达，是否与绒山羊毛囊生长发育有关，是否可作为绒毛生长的关键调控基因还有待研究。

因此，本研究利用生物信息学方法分析绒山羊JAG1蛋白理化性质和结构特征；通过免疫组化和qRT-PCR检测内蒙古绒山羊皮肤毛囊不同时期JAG1的表达部位和表达水平，为深入研究绒山羊JAG1对毛囊发育调控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1试验动物

从内蒙古阿拉善种羊场选择体格相等、无疾病、2周岁内蒙古绒山羊阿拉善型母羊3只，采集毛囊退行期(1月)、休止期(4月)、生长前期(7月)和生长期(9月)皮肤样品。

1.1.2皮肤样品的采集

在绒山羊体侧中线肩胛骨后缘5 cm处用消过毒的刀片采取2～4.0 cm2大小皮肤样品2块，1块装入标有耳号的冻存管后立即投入液氮中，带回实验室至-80 ℃冰箱保存备用。另1块放入现用现配的4%多聚甲醛溶液中固定24 h，之后分别以75%、80%和90%乙醇依次脱水之后无水乙醇中保存。

1.1.3主要试剂和仪器

60 ℃进口石蜡(Leica，德国)，4%多聚甲醛(现用现配)、苏木素、伊红和饱和碳酸锂(Sigma，美国)，鼠源Anti-JAG1-Antibody(一抗)(Santa，美国)，UltraSensitiveTMS-P超敏试剂盒(鼠/兔)(二抗)、DAB显色试剂盒(迈新，中国)，Trizol试剂盒、M-MLV Reverse Transcriptase(Invitrogen，美国)，Power SYBER®Green PCR Master Mix (Applied Biosystems，美国)，dNTP Mixture(TAKARA，大连)，RQ1 RNase-Free Dnase、Recombinant RNasin®RNase Inhibitor(Promega，美国)等。

石蜡切片机(Leica，德国)，真空抽泵(TAISITE，天津)，烘片机(惠友，浙江),显微镜(Nikon，日本)，成像系统(Nikon，日本)，QuantStudio TM 7 Flex Real time PCR system(Applied Biosystems，美国)，凝胶成像系统CBC/UVP I-D001(CapitalBio，北京)等。

1.2 试验方法

1.2.1绒山羊JAG1生物信息学分析

从NCBI数据库获取绒山羊、绵羊、牛、马、猪、骆驼、羊驼和人等物种的JAG1蛋白氨基酸序列，利用MEGA 7.0软件构建系统进化树。

通过ExPASy在线软件中的ProtParam和ProtScale软件分别分析绒山羊JAG1蛋白质的理化性质和亲疏水性；使用SignalP 5.0 Server和TMHMM Server V 2.0在线工具预测绒山羊JAG1蛋白信号肽和跨膜结构；借助运用NetPhos 3.1 Server、NetOGlyc 4.0 Server和NetNGlyc 1.0 Server软件预测JAG1蛋白的磷酸化和糖基化位点；利用SOPMA程序预测JAG1蛋白的二级结构。

1.2.2内蒙古绒山羊JAG1蛋白表达定位检测

内蒙古绒山羊皮肤样品组织切片置于切片架上放入烘片机内65 ℃烘干30～40 min；二甲苯脱蜡15 min之后回水；滴加3% H2O2，室温静置15 min后1×PBS洗3次；加一滴蓝色的山羊非免疫血清，室温静置15 min后1×PBS洗3次；滴加鼠源Anti-JAG1-Antibody置于4 ℃冰箱过夜(至少16 h)；吸取一抗后切片用1×PBS洗3次，滴加生物素标记的羊抗鼠IgG(二抗)(黄色液体)室温静置10～15 min 后1×PBS洗3次；滴加链霉素康生物素蛋白-过氧化酶(橙色液体)室温静置10～15 min后1×PBS洗3次；利用现配现用的DAB显色液显色，边显色边在显微镜观察，在蒸馏水中终止显色；浓度递增梯度酒精脱水，二甲苯透明后封片，镜检。

1.2.3皮肤总RNA提取和反转录

按照 Trizol试剂盒方法提取绒山羊1月、4月、7月和9月皮肤的总RNA，使用紫外分光光度计测定RNA 浓度和OD值， 将符合要求的RNA按照反转录试剂盒的说明书合成cDNA后将其保存到-20 ℃备用。

1.2.4内蒙古绒山羊JAG1基因皮肤不同时期表达分析

根据Genebank中绒山羊JAG1基因序列设计实时荧光定量PCR引物(表1)，以β-actin作为内参基因，其引物根据Genebank中绒山羊β-actinmRNA(登录号：NM_001314342.1)序列设计(表1)，并通过实时荧光定量PCR仪器检测JAG1基因在内蒙古绒山羊不同月份皮肤中的表达。总反应体系为20 μL：2×Power SYBER®Green Master Mix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 8 μL。反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，退火和延伸60 ℃ 1 min，40个循环，然后以0.5 ℃/10 s的速率从60 ℃ 缓慢升温至95 ℃。每个时期的样品重复检测3次。

表1 荧光定量PCR引物序列信息Table 1 Information of fluorescence quantitative PCR primer sequence and product length

1.2.5数据分析

获得荧光定量PCR检测Ct值数据后利用2-ΔΔCt法计算毛囊发育4个时期的相对表达量，并使用SPSS 22.0统计软件对JAG1基因在绒山羊不同毛囊生长期的表达量进行单因素方差分析和显著性检验，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 绒山羊JAG1氨基酸相似性分析

利用MEGA7.0软件对绒山羊、绵羊、牛、马、猪、羊驼、骆驼和人等物种的JAG1氨基酸序列相似性分析，并构建了物种系统进化树(图1)。结果显示，绒山羊与绵羊JAG1亲缘关系最近，相似性达到99.5%，与牛、马、猪、羊驼、骆驼和人的相似性分别为98.4%、95.7%、95.5%、95.5%、95.4%和95.3%，表明JAG1在哺乳动物进化中比较保守。

图1 JAG1氨基酸系统进化树Fig.1 JAG1 amino acid phylogenetic tree

2.2 绒山羊JAG1蛋白基本理化性质分析

绒山羊JAG1基因编码1 218个氨基酸，通过ExPASy在线软件预测发现，JAG1蛋白质的分子式是C5591H8630N1672O1835S146，相对分子量为133 310.89 ku，等电点为5.67，脂肪系数为50.76，半衰期为30 h，不稳定系数为46.35，属于不稳定蛋白。JAG1蛋白包含20种氨基酸，其中出现频率较高的是Cys(10.8%)，Gly(9.2%)，Ser(7.7%)。带正电荷的氨基酸(Arg+Lys)为114个，带负电荷的氨基酸(Asp+Glu)为141个，因此JAG1蛋白整体带负电。亲疏水性分析发现，该基因编码的蛋白质疏水性最大值为3.211，位于第20个氨基酸位点，亲水性最小值为-3.056，位于第1 199～1 200位个氨基酸(图2)，总平均亲水性为-0.585，为亲水性蛋白。

图2 绒山羊JAG1蛋白亲疏水性分析Fig.2 Hydrophilic and hydrophobic analysis of cashmere goat JAG1 protein

2.3 绒山羊JAG1蛋白结构特征分析

绒山羊JAG1蛋白信号肽预测结果如图3(a) 所示，JAG1蛋白信号肽预测值为0.992 8，大于阈值0.5，表明该蛋白有信号肽的分泌蛋白，信号肽位于第1～29个氨基酸序列。剪切位点在第30和31位氨基酸之间，几率为0.463 3。跨膜结构预测发现，该蛋白存在一个跨膜结构(图3(b))。运用NetPhos 3.1 Server、NetOGlyc 4.0 Server和NetNGlyc 1.0 Server软件预测JAG1蛋白的磷酸化和糖基化位点发现，绒山羊JAG1蛋白具有61个丝氨酸、26个苏氨酸、19个酪氨酸磷酸化位点(图3 (c))，有63个O-糖基化位点，第143、217、745、960、991和1 110氨基酸残基处有N-糖基化位点。二级结构预测结果显示，该蛋白中α-螺旋占12.64%，β-转角占4.68%，延伸连占14.29%，无规则卷曲占68.39%(图3(d))。

(a)信号肽预测；(b)跨膜结构预测；(c)磷酸化位点预测；(d)二级结构预测 (a) Signal peptide prediction; (b) Transmembrane structure prediction; (c) Phosphorylation site prediction; (d) Secondary structure prediction 图3 绒山羊JAG1蛋白结构特征分析Fig.3 Structural characteristic analysis of Cashmere goat JAG1 protein

2.4 内蒙古绒山羊JAG1蛋白在毛囊中的表达定位

采集内蒙古绒山羊毛囊4个不同生长期皮肤样品进行免疫组化研究。结果表明，毛囊退行期和休止期毛囊中未检测到JAG1蛋白表达(图4 (a)和(b))；生长前期和生长期在毛囊毛乳头细胞中检测到JAG1蛋白阳性信号(图4 (c)和(d)中箭头指示)。

(a)退行期；(b)休止期；(c) 生长前期；(d)生长期 (a) Catagen; (b) Telogen; (c) Early stage of anagen; (d) Anagen 图4 内蒙古绒山羊JAG1蛋白的毛囊表达定位分析Fig.4 Localization of JAG1 protein expression in hair follicle of Inner Mongolia Cashmere goat

2.5 内蒙古绒山羊皮肤毛囊不同生长期JAG1 mRNA的表达

以β-actin基因作为内参基因，通过qRT-PCR法检测JAG1mRNA在内蒙古绒山羊不同毛囊时期的皮肤中的表达水平。结果显示，JAG1mRNA在毛囊4个时期的皮肤中均有表达，退行期、休止期和生长前期的表达差异不显著(P>0.05)，但毛囊生长期在皮肤中的表达量显著高于其他3个时期的表达量(P<0.05)(图5)。

3 讨 论

绒山羊羊绒的生长受光周期和多种刺激抑制信号的调控，并呈现明显的季节性。绒山羊的毛囊生长包括生长期，退行期和休止期[16]。生长期的特征是毛囊角化细胞的快速增殖和毛干的伸长和增厚。退行期毛球上皮细胞群开始凋亡，毛囊长度收缩，缩回到皮肤表面。休止期毛囊毛乳头进入休眠，上皮细胞变成一个小“指头”[17]。毛囊中含有独特的毛囊上皮和间充质成分，其相互作用引起毛囊周期性变化[18-19]。

不同字母代表差异显著(P<0.05)，相同的字母代表差异不显著(P>0.05)。 Different letters in the column represent significant differences (P<0.05) while same letters represent no significant differences(P>0.05)。图5 内蒙古绒山羊JAG1 mRNA在不同毛囊生长期的表达量Fig.5 Expression levels of JAG1 mRNA in different hair follicle growth period of Inner Mongolia cashmere goats

本研究以绒山羊JAG1为研究目标，首先对JAG1蛋白进行生物信息学分析发现，绒山羊与其他7个物种的JAG1氨基酸序列相似性均90%以上，表明JAG1在进化过程中比较保守，蛋白质结构比较相近。这意味着该基因在绒山羊、绵羊、牛、马、猪、骆驼、羊驼和人等哺乳动物皮肤毛囊中的作用具有同源性。对JAG1蛋白质的理化性质分析发现，绒山羊JAG1蛋白的半衰期为30 h，却不是稳定性蛋白，出现这种不一致的特性可能与其特殊的作用方式或Notch其他配体有关，需进一步研究和探讨。绒山羊JAG1信号肽位于第1～29个氨基酸序列，并且预测值达到0.992 8(大于阈值0.5)，表明JAG1是分泌到胞外的蛋白质。在线软件预测发现JAG1蛋白有一个剪切位点和一个跨膜结构，分析氨基酸序列发现有多个磷酸化和糖基化位点，Gupta等[20]研究表明，磷酸化和糖基化是蛋白质一种修饰方式，磷酸化是细胞内对蛋白功能进行调控的普遍机制，糖基化是细胞产生不同功能蛋白质的一种形式。因此，本研究推测这些磷酸化和糖基化位点可能是调控绒山羊JAG1蛋白功能的关键位点。

通过免疫组化和qPCR技术检测了JAG1在内蒙古绒山羊皮肤中表达部位和相对表达量。免疫组化试验发现，在退行期和休止期毛囊中未检测到JAG1蛋白的表达，毛囊生长前期和生长期在毛乳头细胞中表达。这一结果与Ambler等[21]对小鼠皮肤JAG1基因表达调控研究一致，利用原位杂交试验发现，在小鼠毛囊生长期JAG1mRNA在毛球基质层(邻近奥伯线)细胞里表达。JAG1的表达会激活Notch信号通路，从而诱导毛囊干细胞的分化，促进毛发生长[7]。qPCR结果表明，JAG1mRNA在退行期、休止期和生长前期皮肤中均有表达，但差异不显著(P>0.05)，到生长期JAG1mRNA表达量显著增加(P<0.05)，与Estrach等[7]的小鼠JAG1基因表达研究结果一致。从免疫组化和qPCR结果看出，JAG1蛋白在内蒙古绒山羊皮肤毛囊生长期表达增强，诱导新毛囊生长。JAG1基因缺失可导致毛囊转化为毛囊间表皮分化细胞的囊肿；相反，会引发毛囊基部扩张、皮脂腺增大[7]。JAG1基因促进毛发生长可能与Notch信号通路、β-catenin有关，毛囊中有活性的β-catenin/Lef1诱导JAG1表达，进而激活真皮乳头细胞中的Notch位点，促进毛囊细胞分化[7]。也可能与调节性T细胞有关，皮肤中常驻的调节性T细胞优先表达高水平的JAG1，而JAG1的表达促进毛囊干细胞分化和毛囊再生[13]。因此，JAG1参与人、小鼠和山羊等哺乳动物的毛囊形态构建，诱导毛囊形成毛母质、根鞘、毛干等结构，是调控内蒙古绒山羊毛囊周期性生长的候选基因之一。

4 结 论

绒山羊JAG1氨基酸序列在物种进化过程中比较保守， JAG1在内蒙古绒山羊毛囊退行期和休止期表达较低，且随着毛囊进入生长期其在毛乳头细胞中表达，并表达量逐渐增加。综上，绒山羊JAG1在毛囊发育和周期性生长中具有调控作用，对进一步研究JAG1调控绒山羊绒毛生长相关机制提供理论基础。