四川省食品动物源大肠杆菌mcr-1与ESBLs基因共转移分析

仇剑宇 舒 刚 杨承霖 甘 婷 林居纯

(四川农业大学 动物医学院，成都 611130)

多黏菌素类是医学临床上治疗多重耐药阴性菌感染的关键抗生素，被认为是临床用药最后一道防线[1]。上世纪80年代初，多黏菌素在我国被批准用于养殖业，作为药物饲料添加剂以防治动物肠道感染和促进生长[2]。在较长一段时间，临床检测发现细菌对多黏菌素的耐药性维持在较低水平，且耐药性由染色体介导，只能垂直传播[3]。近年来，耐药性监测发现食品动物源细菌对多黏菌素耐药率明显上升。2015年Liu等[4]首次从猪源大肠杆菌携带的质粒中检出mcr-1基因，且发现该基因编码的MCR-1蛋白能导致细胞质膜上脂质A被磷酸乙醇胺共价修饰，使细菌细胞外膜与多黏菌素亲和力下降，导致对多黏菌素类耐药。此后，在全球各地，包括患者、环境、食品、家养和野生动物源分离菌中均检出mcr-1[5]。回顾性监测发现，早在上世纪80年代，我国鸡源大肠杆菌中就存在mcr-1。随时间推移，该基因检出率呈爆发式上升，尤其在食品动物源菌株中检出率非常高[3,5]，如2018年我国猪源大肠杆菌中mcr-1检出率高达76.2%[6]。通过动物源和人源mcr-1阳性菌株分子特性比较发现，通过食物链、水等自然环境或与动物直接接触，该基因存在从动物扩散到人的可能，这给公共安全造成了威胁[5]。

研究表明，携带mcr-1的质粒类型具有多样性，最常见有IncI2，IncHI2和IncX4型质粒。这些质粒可以在肠杆菌科细菌间发生接合转移，其中IncI2和IncHI2可同时携带ESBLs、PMQR和其他耐药基因，导致多耐药基因共转移[7-8]。多耐药基因共转移会造成在使用其他抗生素时，也会对mcr-1产生选择作用，使得mcr-1的扩散和耐药问题更加严重。四川省是中国畜牧业大省，养殖规模逐年扩大，多重耐药菌株的出现严重威胁着畜牧生产的健康发展。大肠杆菌作为食品动物体内最常见的致病菌和共栖菌，是耐药性传播的重要细菌，也是目前报道最易携带mcr-1的菌种，约占mcr-1阳性菌株91%[5]，可将多耐药基因传递给其他致病菌，甚至通过环境、食品等再传播给其他动物和人类。因此，调查大肠杆菌中耐药基因的流行情况，对四川省的耐药性检测是非常重要的。本次研究以四川省各地收集的不同动物源大肠杆菌为对象，检测mcr-1以及超广谱β-内酰胺酶ESBLs基因流行情况，通过质粒接合转移试验揭示耐药基因发生共转移的耐药机制。

1 材料与方法

1.1 菌株

190株大肠杆菌于2017—2018年从四川省不同养殖场患病猪、鸡、兔体内分离鉴定获得，其中156株鸡源大肠杆菌，25株猪源大肠杆菌，9株兔源大肠杆菌；质控菌ATCC25922和耐叠氮钠大肠杆菌J53 AZr由中国农业大学基础兽医学系兽医药理学教研室惠赠。

1.2 主要试剂

氨曲南等购自四川制药制剂有限公司；小量质粒提取试剂盒购自OMEGA公司；2×Taq PCR MasterMix等购自成都擎科梓熙生物技术有限公司。

1.3 药物敏感性试验

采用微量肉汤稀释法检测190株大肠杆菌对氨苄西林(AMP)、头孢噻肟(CTX)、氨曲南(ATM)、庆大霉素(GEN)、阿米卡星(AMK)、环丙沙星(CIP)和多黏菌素E(COL)最小抑菌浓度(MIC)，以大肠杆菌ATCC25922株作为质控菌株。药敏折点参考CLSI-M100-S29[9]和EUCAST9.0标准判读[10]。

1.4 菌株mcr-1及ESBLs基因检测

采用E.Z.N.A.®Plasmid DNA Mini Kit I提取190株大肠杆菌的质粒DNA。mcr-1阳性菌株的ESBLs基因(blaTEM、blaCTX-M-1 group、blaCTX-M-2 group、blaCTX-M-9 group、blaCTX-M-8/25 group、blaSHV和blaOXA)采用PCR检测，靶基因、引物序列等见表1。PCR扩增产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测后送至成都擎科梓熙生物测序，将获得的耐药基因序列和GenBank核酸序列进行BLAST比对。

1.5 质粒接合转移试验

将mcr-1阳性大肠杆菌(供体菌)与大肠杆菌J53 AZr(受体菌)进行肉汤接合试验。接合子用含药(2 μg/mL多黏菌素E和200 μg/mL叠氮钠)胰蛋白胨大豆琼脂平板进行筛选[14]。采用微量肉汤稀释法检测接合子药物敏感性，提取接合子质粒DNA扩增相关耐药基因。

1.6 数据统计及分析

使用SAS9.0软件FREQ程序进行耐药率组间差异性分析，P>0.05为差异不显著，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 菌株mcr-1基因检测及耐药分析

190株大肠杆菌的mcr-1检出率为36.84%(70/190)(图1)，其中，鸡源和猪源菌株mcr-1检出率分别为41.67%(65/156)和20.00%(5/25)，尚未在兔源菌中检出该基因。

表1 mcr-1及ESBLs基因扩增引物信息Table 1 Information of specific primers for mcr-1 and ESBLs genes

M，DNA标记DL 2 000；1～2，mcr-1阴性菌株； 3～6，mcr-1阳性菌株 M， DNA Marker DL 2 000； 1-2, mcr-1 negative strain； 3-6, mcr-1 positive strain 图1 部分鸡源大肠杆菌mcr-1基因PCR扩增Fig.1 PCR amplifications of mcr-1 of E.coli in chickens

药敏试验显示，190株菌除对庆大霉素(GEN)耐药率为27.37%，对其余药物的耐药率均超过30%，其中对氨苄西林(AMP)高达95.79%，其次是氨曲南(ATM)65.26%、多黏菌素E(COL)47.89%、头孢噻肟(CTX)35.26%、阿米卡星(AMK)32.63%和环丙沙星(CIP)32.11%。比较mcr-1阳性和阴性菌株的耐药性可见，mcr-1阳性菌株对氨曲南(ATM)、头孢噻肟(CTX)和多黏菌素E(COL)耐药率极显著高于mcr-1阴性菌(P<0.01)，对其他药物的耐药率差异均不显著(P>0.05)(图2)，其中mcr-1阳性大肠杆菌对多黏菌素E(COL)耐药率高达92.9%。

2.2 mcr-1阳性菌的ESBLs基因检测

70株mcr-1阳性菌携带质粒大小约为2 kb>15 kb，75.71%菌株检出了ESBLs基因。测序结果显示，blaTEM-1、blaCTX-M-55和blaCTX-M-14的检出率分别为71.43%、22.86%和17.14%，未检出其他ESBLs基因(图3)。

2.3 mcr-1阳性菌株的质粒接合转移分析

mcr-1阳性菌株质粒接合转移率为47.14%(33/70)。33株mcr-1阳性接合子及其供体菌的MICs、耐药率比较可见，接合子及其供体菌对多黏菌素E的MIC在2～8 μg/mL，说明菌株对多黏菌素E(COL)呈低水平耐药。接合子对头孢噻肟(CTX)、氨曲南(ATM)、庆大霉素(GEN)、阿米卡星(AKM)、环丙沙星(CIP)和多黏菌素E(COL)的MIC50值低于供体菌，但两者的MIC90值和耐药率无显著性差异(表2)。

**表示差异极显著(P<0.01)，ns表示差异不显著(P>0.05)。 ** indicates extremely significant difference (P<0.01). ns indicates no significant difference (P>0.05). AMP：氨苄西林；CTX：头孢噻肟；ATM：氨曲南；GEN：庆大霉素；AMK：阿米卡星；CIP：环丙沙星；COL：多黏菌素E AMP： ampicillin； CTX： cefotaxime； ATM： aztreonam； GEN： gentamicin； AMK： amikacin； CIP： Ciprofloxacin； COL：Colistin 图2 mcr-1阳性和阴性菌株耐药率比较Fig.2 Comparison of resistant rates between mcr-1 positive and negative strains

M，DNA标记DL2 000；(a)-1、(b)-1、(c)-1、(d)-4为阳性菌株；其余为阴性菌株。 M， DNA Marker DL2 000； (a) -1， (b) -1, (c) -1 and (d) -4 were positive strains； The rest were negative strains.图3 β-内酰胺类基因(ESBLs)PCR 扩增Fig.3 PCR amplifications of β-lactamase genes (ESBLs)

对33株接合子基因检测显示，19株接合子只检出mcr-1基因，14株同时检出mcr-1和ESBLs基因，其中同时检出blaTEM-1(13株)、blaCTX-M-55(9株)和blaCTX-M-14(2株)；与供体菌相比，尽管14株共转移接合子对庆大霉素(GEN)、阿米卡星(AKM)、环丙沙星(CIP)等药物的MIC值仅为供体菌的1/2或1/32，但却是受体菌J53 AZr的几十甚至几百倍，而且保留了对多黏菌素、β-内酰胺类药物较高的耐药率(表3)；分析接合子质粒可见，大小分别约为5、8和>15 kb质粒，其中～5 kb质粒仅携带mcr-1，～8和～>15 kb质粒同时携带mcr-1和ESBLs基因(表3)。

3 讨论与结论

随着抗生素的长期使用或滥用，耐药性问题已成为全球公共安全最严重的威胁之一。“One health”理念中，动物在“人类—动物—环境”整体健康中占重要地位。目前对食品动物源细菌耐药性监测，更注重那些在医学临床使用的关键药物，如第三代头孢、氟喹诺酮类和多黏菌素等[15]。本研究耐药性检测结果显示，四川省食品动物源大肠杆菌除对氨苄西林、庆大霉素、环丙沙星等兽医临床常用药物耐药外，对头孢噻肟、氨曲南、阿米卡星等兽医临床未批准使用的药物也呈严重耐药性(耐药率范围32.63%～65.26%)。这说明耐药性的产生不仅与抗菌药物使用强度有关，可能还与不同抗菌药物间存在交叉或共耐药相关[16]。

表2 33株接合子(TCs)及其供体菌的MIC50，MIC90及耐药率Table 2 MIC50, MIC90 and resistant rate of 33 transconjugants and their donors

表3 14株供体菌和接合子(TCS)的MICs、携带质粒大小及ESBLs基因Table 3 The MICs, plasmid size and ESBLs gene of 14 donors and their transconjugants (TCs)

表3(续)

本研究中190株食品动物源大肠杆菌中mcr-1检出率达36.84%，其中鸡源和猪源菌株中mcr-1检出率分别为41.67%和20.00%，高于华东地区鸡源菌株检出率36.66%[17]，与广东等5省2011—2014年猪源菌株检出率21%接近[4]，低于我国其他省份猪、鸡源菌株该基因的检出率(43.86%～76.20%)[6,18]，说明在我国食品动物源大肠杆菌中mcr-1广泛存在，但该基因流行存在地区差异。

研究表明，mcr-1可以与其他耐药基因共存在[19]。本研究从70株mcr-1阳性菌中检出75.71%菌株携带ESBLs基因，这与其他报道认为mcr-1常与ESBLs共存在和共转移一致[19-21]。这也诠释了mcr-1阳性菌株比阴性菌株对第三代头孢类具有更强的耐药性的原因。目前，在我国食品动物源大肠杆菌中blaCTX-M是ESBLs最主要的基因型，其中以blaCTX-M-55和blaCTX-M-14为主[17,22]。本研究在mcr-1阳性菌株中blaCTX-M-55和blaCTX-M-14的检出率分别达22.86%和17.14%，与本研究发现的2010—2016年菌株blaCTX-M基因流行以blaCTX-M-55和blaCTX-M-14为优势基因型相符，所编码的CTX-M酶介导对青霉素类和第3代头孢菌素耐药[23]。此外，mcr-1阳性大肠杆菌中blaTEM-1检出率高达71.43%，说明blaTEM-1在四川省食品动物源大肠杆菌中已经获得了稳固存在和传播的能力。尽管blaTEM-1介导窄谱β-内酰胺酶，但由于该基因容易发生突变导致新的TEM酶出现，扩大水解底物谱，导致多重耐药菌株流行[24]。

R质粒作为介导耐药基因转移的可移动元件，在耐药性水平传播中发挥重要作用。本研究中70株mcr-1阳性菌经质粒接合转移获33株接合子(转移率47.14%)，其中14株发生了mcr-1与ESBLs基因共转移，且参与菌株耐药性的表达，使受体菌对多黏菌素和β-内酰胺类药物产生耐药性。关于37株mcr-1阳性菌株未结合转移成功，可能是菌株携带的质粒属于非结合型质粒，需要通过转化或转导方式在不同菌株间传播。

综上所述，本研究表明在四川省食品动物源大肠杆菌耐药性较严重，且对医学临床使用的关键药物也呈耐药性。耐药菌株中mcr-1流行率较高，与ESBLs基因共存在较普遍，耐药基因借助质粒易发生水平传播，导致多重耐药菌株的产生和流行。这给动物、人类或环境造成巨大威胁，动物养殖业应加强mcr基因与其他耐药基因的监测，针对耐药性问题采取严格防控措施，谨慎和合理有效地使用抗生素，缓解耐药性的产生和传播，保障动物养殖健康发展和畜禽产品质量安全。