HIV-1 感染者免疫活化对宿主限制因子SAMHD1表达和HIV-1 DNA 水平的影响

饶和平 姚水洪 王炜 靳昌忠

1衢州职业技术学院医学院“衢州市病毒致瘤研究科技创新团队”（浙江衢州 324000）；2衢州市疾病预防控制中心艾滋病实验室（浙江衢州 324000）；3浙江大学医学院附属第一医院传染病诊治国家重点实验室（杭州 310003）

不育-α-基序结构域和组氨酸/天冬氨酸残基双联体结构域包涵蛋白1（sterile alpha motif domain and HD domain 1，SAMHD1）是一种HIV-1 宿主限制因子，它通过水解dNTP 降低细胞内dNTP水平，使病毒逆转录过程由于缺乏足够的dNTP而受阻［1-4］。SAMHD1 的表达受干扰素调控［5-6］，HIV-1 感染者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）中的SAMHD1表达与血浆IFNα浓度呈正相关［7］。HIV-1 DNA水平是HIV-1储藏库的指标，SAMHD1 可以限制HIV-1 RNA 逆转录成DNA，进而影响HIV-1 储藏库的形成［8-10］。体外研究发现SAMHD1 可以影响靶细胞内的HIV-1 DNA 水平［11-12］，但HIV-1 感染者体内SAMHD1 是否对CD4+T 细胞HIV-1 DNA 水平有影响目前还不清楚。本文研究了SAMHD1 表达与免疫活化和HIV-1 DNA 水平的关系，初步探索SAMHD1 与HIV-1 储藏库的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象HIV-1 感染者来自2019 年8-11 月期间浙江大学附属第一医院就诊患者。纳入标准：年满18 周岁且不超过（含）75 周岁，经初筛和确认试验HIV-1 抗体阳性；排除标准为：近期有机会性感染，或并发肿瘤或风湿免疫性疾病，或合并HBV/HCV 感染。共选取57 例未接受抗病毒治疗的HIV-1 感染者作为未治疗组，62 例接受抗病毒治疗1 年以上且病毒载量低于检测限的HIV-1 感染者作为治疗组，48 例健康体检者作为健康对照组。本研究得到浙江大学附属第一医院伦理委员会批准，所有研究方案均告知患者本人，并签订了知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 HIV-1 RNA 及DNA 检测HIV-1 RNA 检测采用HIV-1 Monitor 1.5（Roche 公司，瑞士）试剂盒，在COBAS Amplisemsor-PCR 仪上，对血浆样品的HIV-RNA 作定量分析，操作按照试剂盒说明进行，结果以每毫升血浆含病毒拷贝数表示，最低检测限50 拷贝/mL。细胞内的HIV-1 DNA 检测先使用QIAamp DNA Blood Mini kit（凯杰公司，德国）提取外周血总DNA，按说明书操作进行。采用HIV-1 DNA Detection Kit（PCR-Fluorescent Probing）（广州海力特公司）试剂盒检测HIV-1 感染者外周血HIV-1总DNA。取5 μL DNA 模板，加入45 μL PCR 预混液中。反应条件为：（1）37 ℃5 min，95 ℃10 min；95 ℃15 s，65 ℃15 s，72 ℃20 s，反应5 循环；（2）95 ℃15 s，62 ℃15 s，72 ℃20 s，反应40 循环；（3）95 ℃15 s，52 ℃15 s，72 ℃32 s，反应10 循环。细胞中HIV DNA 含量结果计算：同步扩增标准品，绘制标准曲线，分别定量每份样本中HIV DNA（单位：拷贝/mL），除以PBMC 定量结果（单位：个/mL），再乘以106得出标本中每106个细胞中HIV DNA 含量（单位：拷贝/兆细胞）。

1.2.2 CD4+T细胞定量和免疫活化检测以CD4+T细胞表面CD38 分子的表达作为CD4+T 细胞免疫活化的标志［13-14］，使用美国Coulter 公司流式细胞仪和三色标记CD3/CD4/CD38 单抗绝对定量试剂盒进行检测，取全血50 μL，用20 μL 单克隆抗体混合物孵育1 h，用红细胞裂解液裂解红细胞之后上机检测。用systemU 软件进行分析。

1.2.3 血浆IFNα 水平检测采用人IFNαELISA检测试剂盒（R&D 公司）检测血浆IFNα 水平，操作按照说明书所述步骤进行。

1.2.4 SAMHD1表达定量检测每人抽取EDTA抗凝血5 mL，用密度梯度离心法分离PBMC，并进一步用CD4+T 细胞分选磁珠（美天旎公司，德国）分选CD4+T 细胞。用TRIzol 溶液（Invitrogen，美国）提取PBMC 和CD4+T 细胞总体RNA 后，采用PrimeSciptTM逆转试剂盒和SYBR 定量检测试剂（大连宝生物有限公司）进行逆转录和实时荧光定量PCR 反应。反应条件为：先在95 ℃反应30 s，再在95 ℃5 s 和60 ℃30 s 反应40 循环。SAMHD1 mRNA 检测上游引物为：5′-AAAACCAGGTTTCACAACTTCTGC-3′，下游引物为：5′-TGCGGCATACAAACTCTTTCTGT-3′，以GAPDH 为内参（上游引物：5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′下游引物：5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′）。利用2-ΔΔCt相对定量法来计算SAMHD1 的相对表达量。

1.3 统计学方法使用SPSS 20.0 软件进行统计分析，HIV-1 病毒载量、HIV-1 DNA 和SAMHD1 mRNA 水平以M（P25，P75）表示，其余数据以均值±标准差表示，非正态分布数据及方差不齐的正态分布数据采用非参数检验，正态分布且方差齐的数据两两比较采用student-t检验，三组比较采用单因素方差分析，采用Pearson 检验分析数据的相关性，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HIV-1 感染者基本情况57 例未接受抗病毒治疗者CD4+T 细胞数（276.1±104.8）个/μL，病毒载量63 055（5 149，525 371）拷贝/mL；62 例接受抗病毒治疗者平均抗病毒治疗（3.6±2.1）年，平均CD4+T 细胞数（405.3±131.2）个/μL，病毒载量均低于检测限，见表1。

表1 研究对象临床信息及免疫学和病毒学指标Tab.1 Clinical information，immunological and virological indexes of subjects

表1 研究对象临床信息及免疫学和病毒学指标Tab.1 Clinical information，immunological and virological indexes of subjects

2.2 HIV-1 感染者CD4+T 细胞免疫活化和干扰素IFN-α 水平HIV-1 感染者未治疗组平均CD4+CD38+T 细胞百分比为（40.7 ± 5.3）%，高于治疗组（29.8 ± 3.6）%（P＜0.01），两组均显著高于健康对照组（17.5 ± 1.3）%（P＜0.01）。HIV-1 感染者血浆IFN-α 浓度显著高于正常对照组（P＜0.01），升高约2～3 倍；未治疗组和HAART 治疗组之间差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

2.3 HIV-1 感染者外周血HIV-1 DNA 水平未治疗组HIV-1 DNA水平为781.3（427.6，963.5）拷贝/兆PBMC，或902.6（493.9，1 265.3）拷贝/mL 全血，高于治疗组117.2（73.4，163.1）拷贝/兆PBMC，或201.8（132.7，248.2）拷贝/mL 全血（P＜0.01）。见表1。

2.4 HIV-1 感染者PBMC 和CD4+T 细胞中SAMHD1 表达水平未治疗组HIV-1 感染者PBMC 中SAMHD1 mRNA 相对表达水平为12.2（7.9，16.1）×10E-4，治疗组HIV-1感染者PBMC中SAMHD1 mRNA相对表达水平为15.7（8.1，18.9）×10E-4，均高于健康对照组［3.7（0.7，5.6）×10E-4］（P＜0.01）。未治疗组HIV-1 感染者CD4+T 细胞中SAMHD1 mRNA 相对表达水平为1.3（0.8，1.9）×10E-4，治疗组HIV-1感染者CD4+T 细胞中SAMHD1mRNA 相对表达水平为1.7（0.9，2.4）×10E-4，均低于健康对照组［4.1（3.3，5.2）×10E-4］（P＜0.01）。治疗组和未治疗组之间差异均无统计学意义。见表1。

2.5 HIV-1感染者SAMHD1 mRNA表达与HIV-1 DNA 和细胞免疫活化相关性两组感染者CD4+T细胞SAMHD1 mRNA 的表达与免疫活化均呈负相关，未治疗组R值为-0.81（P＜0.01），治疗组R值为-0.78（P=0.015）；未治疗组PBMC 中SAMHD1 mRNA 的表达与CD4+T 细胞免疫活化呈负相关，R值为-0.31（P=0.03），治疗组R值为-0.42（P=0.15）。两组感染者PBMC和CD4+T细胞中SAMHD1 mRNA的表达水平与外周血HIV-1 DNA 水平均无显著相关性，见表2。

表2 SAMHD1 表达与免疫活化和HIV-1 DNA 水平的相关性Tab.2 Correlation between SAMHD1 expression and immune activation and HIV-1 DNA level

3 讨论

SAMHD1 是髓系细胞（如树突状细胞和巨噬细胞）中HIV-1 感染的主要限制因子［15］，静息CD4+T 细胞高表达SAMHD1 并可以减少HIV-1 的感染［16-17］。本研究发现HIV-1 感染者PBMC 中SAMHD1 表达升高，这与先前的研究一致［6］，但是CD4+T 细胞中SAMHD1 表达有所下降。对于PBMC 和CD4+T 细胞中SAMHD1 表达趋势相反的现象，可能与以下原因有关：HIV-1 感染者CD4+T 细胞数量下降，导致PBMC 的组成比例发生改变，髓系细胞比例相对升高；HIV-1 感染者高表达SAMHD1 的静息CD4+T 比例明显降低，活化细胞比例上升［6］，从而导致平均SAMHD1 表达水平下降。

干扰素α 可以诱导SAMHD1 的表达［7］，HIV-1感染者PBMC 中SAMHD1 表达升高可能与干扰素水平升高有关。CD4+T 细胞中SAMHD1 表达受免疫活化影响更大。笔者发现HIV-1 感染者CD4+T细胞中SAMHD1 mRNA 表达均较健康对照显著下降，与CD4+T 细胞免疫活化呈显著的负相关性，这可能与HIV-1 感染者CD4+T 细胞广泛活化，静息细胞比例减少有关。及早抗病毒治疗不仅可以抑制HIV-1 的复制，还可以降低CD4+T 细胞免疫活化［13］。

SAMHD1 对逆转录过程的抑制会导致HIV-1总DNA 的产生减少［18-19］研究发现，与未治疗组比，抗病毒治疗患者外周血中HIV-1 总DNA 水平显著降低。CD4+T 细胞SAMHD1 表达与HIV-1 总DNA水平之间没有显著相关性。HIV-1 总DNA 水平受很多因素影响，除SAMHD1 以外还包括HIV-1 RNA 水平、活化CD4+T 细胞数量、外泌体2LTR等［19-20］。

总之，本研究发现，HIV-1 感染者CD4+T 细胞中SAMHD1 的表达与CD4+T 细胞免疫活化负相关，与总HIV-1 DNA 水平无明显相关性。本研究显示了及早抗病毒治疗以抑制CD4+T 细胞免疫活化的重要性，较低的CD4+T 细胞免疫活化水平不仅可以减少HIV-1 的靶细胞，还可以提高SAMHD1的表达水平，抑制HIV-1 的整合，从而降低HIV-1的感染及储藏库的形成。