保健品中42种非法添加物的HPLC-MS/MS法快速筛选和测定

李亚庆，陈深树，钟超群，康 刚，焦台风，董成高，杨宇航，程良红

广东南天司法鉴定所，广东 深圳518003

我国保健品行业发展起始于20世纪80年代，改革开放之后，国民经济水平不断提高，人们对保健品的需求有所上升。20世纪90年代至21世纪初，由于监管宽松、高利润等特点，保健品行业飞速发展［1-3］。近年来，随着互联网经济的发展和消费升级的观念不断深入人心，加上国人固有的中医保健思想，保健行业迎来又一个高速发展阶段，整体市场趋向于更加精细化、更加高品质。行业利好背景下，监管新政不断出台，推动行业规范化发展。

因笔者所属行业的特殊性，了解到目前保健品中非法添加化学物质的问题比较突出。这些非法化学添加物质主要有6大类［4-6］：减肥类，代表性物质为西布曲明，有增加心脏病的风险，国家已明令禁止生产和使用；降糖降脂类，代表物质为盐酸丁二胍，易导致乳酸堆积，在我国未获得药监部门批准生产和使用；降压类，代表性物质为尼群地平，超量摄取后可发生心力衰竭和心肌梗死；止咳类，代表性物质有可待因，位于《麻醉药品品种目录》第111号，长期摄入会产生耐受性和成瘾性；精神类，代表性物质为扎来普隆，属于国家特殊管制的第二类精神药品；壮阳类，以添加西地那非为代表的壮阳类保健品在市场上最常见，非法添加易导致心源性猝死和脑出血［7-9］。现有非法添加化学物质的检测方法主要有：拉曼光谱法［10-11］、高效液相色谱法［12-14］、薄层色谱法［15-16］、近红外光谱法［17-18］以及液相色谱-质谱联用法［19-21］等，高效液相色谱-四级杆飞行时间串联质谱法［22］和高效液相色谱-四级杆/静电场轨道阱质谱法［23］，但可筛选的化学添加物质数量有限。近些年来国家食品药品监督管理总局不断出台关于保健品非法添加的补充检验方法，但是随着不法分子对添加物质和添加手段不断改进，现行方法覆盖范围难以满足市场上保健品非法添加的检测要求。同时，近些年随着仪器检测技术不断发展，对保健品中非法添加的检测报道日益增多，但是笔者检索近几年国内文献，能同时高通量快速检定数10种非法化学物质的报道较少。

鉴于此，本文在现行国家标准基础上选择了6大类42种保健品中常见的非法添加的化学物质作为目标物，采用高效液相色谱-串联质谱法，选用多反应监测模式，建立了一套覆盖范围广、耗时少、准确度高的高通量筛查和定量分析保健品中42种非法添加化学物质的方法，参考相关国家标准的方法并用于实际样品检测，出具司法鉴定意见书，检测结果均被办案机关依法采信。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

LC20A高效液相色谱仪（日本岛津公司），LCMS-8045三重四级杆液相色谱质谱联用仪、Labsolutions LCMS集合型工作站软件（日本岛津公司），Millipore Milli-Q纯水系统（美国Millipore公司），AUW220D型电子分析天平（日本岛津公司），Cenece＠ΤDZ5-WS离心机（湖南赛特湘仪离心机仪器公司），KQ-250DE型超声波清洗器（昆山市超声仪器公司）。

盐酸西布曲明（纯度99.9%），盐酸N-单去甲西布曲明（纯度97.7%），盐酸N，N-双去甲西布曲明（纯度94.4%），盐酸氯卡色林（0.1 mg/mL甲醇溶液），酚酞（纯度99.8%），盐酸二甲双胍（纯度99.9%），盐酸苯乙双胍（纯度99.7%），辛伐他汀（纯度99.5%），瑞格列奈（纯度99.8%），盐酸罗格列酮（纯度93.3%），格列齐特（纯度99.9%），格列喹酮（纯度99.5%），卡托普利（纯度99.7%），苯磺酸氨氯地平（纯度100.0%），尼群地平（纯度99.4%），非洛地平（纯度99.6%），盐酸哌唑嗪（纯度99.9%），盐酸可乐定（纯度100.0%），盐酸氯丙那林（纯度99.9%），盐酸二氧丙嗪（纯度99.8%），扎来普隆（纯度100.0%），丁丙诺非（0.1 mg/mL甲醇溶液），硝苯地平（纯度99.9%），烟酸（纯度99.8%），麻黄碱（1.0 mg/mL甲醇溶液），可待因（1.0 mg/mL甲醇溶液），福尔可定（纯度99.3%），盐酸氟西汀（纯度99.3%）等标准品均购自中国食品药品检定研究院；奥利司他（纯度99.8%），盐酸丁二胍（纯度99.9%），甲苯磺丁脲（纯度99.6%）等标准品均购自美国Cerilliant标准品公司；西地那非（纯度98.0%），豪莫西地那非（纯度99.8%），枸橼酸羟基豪莫西地那非（纯度99.4%），那莫西地那非（纯度99.9%），红地那非（纯度99.9%），那红地那非（纯度99.7%），伪伐地那非（纯度99.8%），盐酸伐地那非（纯度99.9%），硫代艾地那非（纯度99.9%），他达拉非（纯度99.8%），氨基他达拉非（纯度99.9%）等标准品均购自英国LGC标准品公司；甲醇、乙腈均为色谱纯，购自德国Merck公司；甲酸、乙酸铵均为质谱纯试剂，购自百灵威试剂公司；实验用水为超纯水。

实际样品来源于深圳市龙华区某派出所、深圳市宝安区某派出所和深圳市某海关依法查获或扣留送检的保健品。

1.2 标准溶液的配制

分别准确称取42种非法添加化学物质标准品10 mg（精确至0.1 mg），置于10 mL容量瓶，用甲醇定容，配置成1 mg/mL的标准储备液；用甲醇稀释至1μg/mL于-20℃避光保存；再用甲醇配制成不同浓度的标准工作液，供上机使用。

1.3 样品处理

准确称取样品约10 mg，置于15 mL聚乙烯离心管中，加入10 mL甲醇，超声萃取30 min，冷却至室温，3 500 r/min离心3 min，取上清液1 mL通过0.22μm滤膜，滤液在50℃下使用高纯氮气吹干，用200μL甲醇复溶，转移至样品瓶，供高效液相色谱-串联质谱（high-performanceliquid chromatography tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）检测。

1.4 基质混标溶液配制

取空白样品，按1.3所述方法制备空白基质溶液，上机前使用空白基质溶液稀释42种化学物质混合标准溶液，制成基质混合标准溶液。

1.5 HPLC-MS/MS条件

1.5.1 液相色谱条件 色谱柱：Restek-UltraⅡPFPP（100 mm×2.1 mm，5μm）；柱温：40℃；流速：0.3 mL/min；进样体积：1.0μL；流动相：A为20 mmol/L乙酸铵和0.1%（体积分数）甲酸缓冲水溶液，B为乙腈；梯度洗脱程序（体积分数）：0～3min，10%～20%B；3～8 min，20%～75%B；8～10 min，80%～95%B；10～12 min，10%B。

1.5.2 质谱条件 离子源：电喷雾离子源（ESI），正离子模式；监测模式：多反应监测（MRM）模式；雾化器流速：3 L/min；干燥器流速：10 L/min；加热气流速：10 L/min；接口电压：4 000 V；接口温度：300℃；DL温度：250℃；加热块温度：400℃。对碰撞能量（CE）、Q1 Prerod偏差电压和Q3 Prerod偏差电压等质谱条件优化，保健品中常见42种非法添加化学物质的多反应监测模式（reaction monitoring mode，MRM）参数如表1所示。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件优化

本研究考察了填充料为十八烷基键合硅胶的Agilent Poroshell 120 EC-C18液相色谱柱和填充料为五氟苯基丙基键合物的Restek-UltraⅡPFPP液相色谱柱的分离效果，发现后者不论在分离效果和峰形上均优于前者，由于极性化合物或者疏水作用类似的物质的分离在C18柱上保留较弱，而PFPP柱分子中含有5个氟原子，具有较强的氢键作用力和阳离子交换作用力，因此本研究选用Restek-UltraⅡPFPP液相色谱柱。为提高各待测物的分离效果，保证检测灵敏度，选用1.5.1所述的梯度洗脱方法，得到的42种化学物质的总离子流色谱图如图1所示。

图1 42种化学物质的总离子流图Fig.1 Τotal ion chromatograms of 42 kinds of substances

2.2 质谱条件优化

质谱条件的优化主要是确定各化学物质的母离子、子离子以及选择合适碰撞能量等。在本研究中，笔者借助安捷伦科技提供的Agilent MRM Database工具，查询化学物质的母离子和子离子并做记录。取1μg/mL的混合化学物质标准溶液直接进样进行母离子扫描，获取各化学物质母离子，然后通过子离子扫描方式获取其子离子，与记录中的各母离子和子离子做对比，选取合适子离子做MRM参数优化以确定Q1 Prerod偏差电压、Q3 Prerod偏差电压和碰撞能量，结果如表1所示。

表1 42种化学物质的动态多反应模式监测参数Τab.1 Optimized MRM parameters of 42 kinds of substances

2.3 方法验证结果

2.3.1 线性方程、检出限和定量限 按1.4所述方法配制系列基质混合标准溶液，以各化学物质的色谱峰峰面积（y）对进样质量浓度（x，ng/mL）进行回归计算，考察42种化学物质的线性关系，线性回归方程及相关系数（r2）如表2所示。结果表明，42种化学物质在10～1 000 ng/mL质量浓度范围内与色谱峰峰面积呈良好的线性关系，相关系数r2均在0.990 3～0.999 7。在空白样品中添加系列质量浓度的混合标准溶液，记录信噪比为3∶1及10∶1时的浓度为检出限（limits of detection，LOD）和定量限（limits of quantification，LOQ）。结果表明，42种化学物质的LOD为0.5～10 ng/g，LOQ为1～50 ng/g，能够满足非法化学添加物质的检测要求。

表2 42种化学物质的线性方程、相关系数、检出限和定量限Τab.2 Linear equation，correlation coefficients，limits of detection and limits of quantitation of 42 kinds of substances

2.3.2 回收率、精密度和稳定性 以空白样品为基质，分别选取低质量浓度（30 ng/g）中质量浓度（600 ng/g）和高质量浓度（1μg/g）3个水平的混合标准溶液，按优化后的实验条件，每个水平做6次平行实验，连续3 d。结果显示，在空白基质中所有化学物质的回收率相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）均小于15%，满足精密度要求。42种化学物质的平均回收率为80.59%～136.76%，3个水平下回收率正态分布曲线如图2所示，RSD为0.41%～13.44%，方法的随机误差满足测定要求。

图2 三个水平下回收率正态分布曲线Fig.2 Normal distribution curves of recovery at three levels

选取1μg/g混合标准溶液，在统一实验条件下连续10次平行实验以评价方法稳定性，分别计算保留时间和出峰面积的相对标准偏差。结果表明，42种化学物质保留时间RSD为0.059%～0.287%，峰面积RSD为0.536%～2.640%，方法稳定性理想。

2.4 实际样品检测

按照上述方法，分别对深圳龙华区某派出所依法查处的4份保健品和深圳宝安区某派出所依法查处的3份保健品，以及深圳某海关依法扣留的8份保健品进行测定并出具司法鉴定意见书。结果表明，深圳龙华区某派出所依法查处的4份保健品中，3份检出他达拉非，定量结果分别为5.5、9.4和7.9 mg/g；深圳宝安区某派出所依法查处的3份保健品中，其中2份分别检出西布曲明和酚酞，定量结果分别为74.7和586.0 mg/g；深圳某海关依法扣留的8份保健品中，1份检出为氟西汀，定量结果为18.6 mg/g，以上结果均被办案机关依法采信。空白基质混合标准溶液（spiked sample，1μg/mL）与实际阳性样品（actual sample）的MRM色谱图和质谱图如图3所示。可见，在保健品行业非法添加化学物质的情况仍存在，相关部门应加强监管力度，严控保健品生产过程，保证产品质量，保障消费者安全。

图3 空白基质混合标准溶液（1μg/mL）和阳性样品的MRM色谱图和质谱图：（a）酚酞，（b）西布曲明，（c）他达拉非，（d）氟西汀Fig.3 MRM chromatograms and mass spectra of spiked samples（1μg/mL）and actual samples：（a）phenolphthalein，（b）sibutramine，（c）tadalafil，（d）fluoxetine

3 结 论

本研究建立了HPLC-MS/MS快速筛选和测定保健品中42种非法添加化学物质的分析方法。该方法样品前处理简便，分析覆盖范围广、耗时少、准确度高，能满足对保健品中非法添加物质的测定要求。在实际样品的检测中，按照本方法对深圳市办案机关送检的保健品检测，非法添加的化学物质均被准确筛查和定量检测并出具司法鉴定意见书，所有送检样品的检测结果均被办案机关依法采信。本方法为保健品中多种非法添加化学物质的定性筛查和定量分析提供了高效、可靠的检测方法。