冷凝回流法制备直链淀粉-色氨酸复合物

刘华玲，闵照永，王永刚，许真，张洋，汪松,3*

1. 鹤壁职业技术学院食品工程学院（鹤壁 458000）；2. 鹤壁市绿色食品深加工重点实验室（鹤壁 458000）；3. 中国科学院地理科学与资源研究所（北京 100101）

L-色氨酸具有生物学活性，在动植物体内可以转化成为5-HT、褪黑素、尼克酸等生物活性物质，并影响血压、痛觉、情绪、睡眠与觉醒及神经内分泌活动，参与代谢调控过程，色氨酸是一种非神经递质类氨基酸，在体内调节蛋白质合成、免疫和消化功能。L-色氨酸是一种必需氨基酸，在人体内无法合成，需要从食物中摄取[1]。色氨酸也是构成蛋白质的20种常见氨基酸之一。膳食中缺乏色氨酸会降低营养水平并抑制免疫功能，从而导致动物对疾病感染、发病率和死亡率的增加[2]。各种研究表明，色氨酸在免疫调节中起关键作用，影响巨噬细胞的吞噬作用。膳食色氨酸的增加可以促进血清免疫球蛋白的合成并增强免疫系统的防御。色氨酸是营养必需氨基酸，对动物免疫应答的调节具有活性[3]。淀粉作为碳水化合物在细胞中重要的储存方式，广泛存在于自然界中，可以作为人体摄取能量的重要来源之一[4]。淀粉主要由直链淀粉与支链淀粉组成，支链淀粉主要是由α-1, 4糖苷键和α-1, 6键连接而成的聚合物[5]，直链淀粉主要是由D-葡萄糖通过α-1, 4-糖苷键连接的线性多糖[6]，可以与各种配体形成复合物[7]。根据X-射线衍射图谱，淀粉可分为A型、B型和C型晶体结构[8]。

在B型微晶淀粉和色氨酸的作用下，采用冷凝回流方式来制备直链淀粉-色氨酸复合物，以复合物的相对结晶度为评价指标，通过单因素试验优化复合物的制备工艺，并对结晶度最佳的复合物进行扫描电子显微镜（SEM）、X-射线衍射（XRD）、红外光谱（FT-IR）、热重（TG）和拉曼光谱（RAMAN）分析和测试，进一步研究直链淀粉-色氨酸复合物的结晶结构和表观特征。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器

马铃薯淀粉，固原长城淀粉有限公司；色氨酸，上海源叶生物科技有限公司；无水乙醇、盐酸，均为分析纯化学试剂。

SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；LG10-2.4A型高速离心机（北京医用离心机厂）；PhilipsXL-3型扫描电子显微镜（SEM）：日本日立公司；BrukerTENSOR27型红外光谱仪（FTIR）、BrukerD8型X-射线衍射仪（XRD）：德国布鲁克公司；TG/DTA-A型综合热分析仪（TG）：日本；便携式拉曼光谱仪BWS465-785S（RAMAN）：美国BWTEK公司；Scientz-12N压盖型冷冻干燥机（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 直链淀粉的制备

按照参考文献[9]的制备方法制备得到。取一定量的马铃薯淀粉，用2.2 mol/L的盐酸配成质量分数为30%的淀粉悬浮液，在35 ℃下恒温酸解3 d，抽滤，用去离子水洗涤4次，再用无水乙醇洗涤3次，收集固体，室温晾干备用。将酸解得到的马铃薯淀粉配成质量分数10%的悬浮液，加热煮沸使其充分糊化，自然冷却到室温，离心分离除去不溶物，上层清液在-18℃下冷冻12 h。将冷冻样品在室温下缓慢解冻，当残余有少量冰晶时，及时抽滤，并用冷水洗涤，收集滤饼，在室温下晾干，即为直链淀粉。

1.2.2 直链淀粉-色氨酸复合物的制备

称取1.00 g直链淀粉与一定量L-色氨酸于三口烧瓶中，加入20 mL去离子水，接冷凝回流管，加热煮沸至透明。将一定量的无水乙醇加入热的淀粉溶液中，混合均匀后，加热回流10 min，关闭电源，随后按不同的结晶温度将溶液冷至室温，静置结晶完成后，离心分离，冷冻干燥后得直链淀粉-色氨酸复合物。

1.2.3 单因素试验

不同淀粉/色氨酸配比对复合物结晶结构的影响：固定乙醇体积分数31.03%、结晶温度60 ℃，淀粉/色氨酸配比分别为6∶1，8∶1，10∶1，12∶1和14∶1。

不同乙醇体积分数对复合物结晶结构的影响：固定结晶温度60 ℃、淀粉/色氨酸配比10∶1，乙醇体积分数分别为31.03%，35.48%，39.39%，43.86%和45.95%。

不同结晶温度对复合物结晶结构的影响：固定乙醇体积分数31.03%、淀粉/色氨酸配比10∶1，结晶温度分别为55，60，70，80和90 ℃。

1.2.4 扫描电子显微镜（SEM）

观察样品之前，利用喷涂仪对样品进行镀金处理，在操作电压为20 kV时，使用扫描电子显微镜（SEM）观测样品的微观形貌。

1.2.5 X-射线衍射（XRD）

取样品粉末置于长方形铝片的孔中（孔大小为15 mm×20 mm，厚为115 mm），随后压紧，用BurkerD8型X射线衍射仪测定，所用波长为0.154 2 nm的单色Cu-Kα射线。测试条件：管压3 kV，管流20 mA，扫描速度4°/min，扫描区域5°～60°，采样步宽0.04°，扫描方式为连续，重复次数为1。相对结晶度的计算，采用Nara等[10]所利用的XRD谱图计算相对结晶度的方法。

1.2.6 红外光谱（IR）

称取约2 mg样品研细，加入150 mg干燥KBr，混合均匀并研细、压片，压片厚约0.5 mm，随后将该薄片进行红外扫描。测试条件：扫描波数范围4 000～400 cm-1，分辨率4 cm-1。采用DTGS检测器，以空气为空白，扫描3次后取平均值得到样品的红外光谱图。

1.2.7 热重分析（TG）

取约3 mg试样置于陶瓷试样皿中，将样品盘压紧密封，测试条件为扫描范围30～600 ℃、升温速率10℃/min。

1.2.8 拉曼光谱分析（RAMAN）

拉曼光谱测试采用了美国BWTEK公司的BWS465-785S型便携式拉曼光谱仪，激发波长为785 nm，激光功率小于300 mW，20倍长焦物镜背向散射测量模式，扫描次数20次，曝光时间10 s。使用100 mW的激光照射，在180°范围内搜集散射辐射，波数范围为175～3 200 cm-1。

1.3 数据处理方法

利用Origin 6.1软件进行数据处理，得到X-射线衍射图谱及红外光谱。

2 结果与分析

2.1 直链淀粉-色氨酸复合物制备条件的优化

2.1.1 淀粉/色氨酸配比对复合物结构的影响

图1为不同直链淀粉/色氨酸配比时，所得复合物的XRD图。探究直链淀粉/色氨酸配比对复合物结构的影响，则需固定乙醇体积分数31.0%、结晶温度60℃，改变直链淀粉/色氨酸配比，制得复合物。5种复合物衍射曲线均在15.16°，17.47°和23.35°左右出现了衍射峰，为A型结晶结构。当直链淀粉/色氨酸配比为14∶1时，衍射峰在三个衍射角的强度均较弱。将图1所得各衍射曲线进行处理，得出各衍射峰强度、峰面积和结晶度，列于表1。

图1 不同直链淀粉/色氨酸配比时所得复合物的XRD图

从表1可以看出，随着直链淀粉/色氨酸比例的升高，相对结晶度先增加后减少，这表明色氨酸的添加量直接影响复合物的结晶度。当直链淀粉/色氨酸配比由6∶1上升至8∶1时，复合物的相对结晶度由50.15%上升至54.69%；当直链淀粉/色氨酸配比由8∶1上升至14∶1时，复合物的结晶度由54.69%下降至47.14%；当直链淀粉/色氨酸的配比达到8∶1时，直链淀粉重结晶形成的复合物结晶结构最佳，色氨酸的量过多或过少都会影响复合物的结晶结构。因此，淀粉/色氨酸的最佳配比为8∶1，相对结晶度可达54.69%。

表1 不同直链淀粉/色氨酸配比时所得复合物结晶度和相关衍射数据

2.1.2 乙醇体积分数对复合物结构的影响

图2为不同乙醇体积分数时，所得复合物的XRD图。探究乙醇体积分数对复合物结晶结构的影响，固定直链淀粉/色氨酸质量配比10∶1、结晶温度60 ℃，改变乙醇体积分数，制得复合物。从图2中可以看出，5种复合物衍射曲线均在15.16°，17.38°和23.60°左右出现了衍射峰，说明色氨酸与B型淀粉复合形成了A型结构。将图2所得各衍射曲线进行处理，得出各衍射峰强度、面积和结晶度，列于表2。

图2 不同乙醇体积分数时所得复合物的XRD图

表2中相关数据显示，随着乙醇体积分数的增加，衍射峰的强度和尖锐程度均呈现先增加后降低的趋势，乙醇体积分数对复合物结晶结构产生影响。这是由于乙醇体积分数过高造成淀粉沉积时间过短，淀粉在溶剂中溶解度下降，未能形成较好的晶型[11]。随着乙醇体积分数的增加，复合物的结晶度先增大后减少，乙醇体积分数为39.39%时，复合物的结晶最好，其结晶度为41.00%。

表2 不同乙醇体积分数下所得复合物结晶度和相关衍射数据

2.1.3 结晶温度对复合物结构的影响

图3为不同结晶温度时，所得复合物的XRD图。从图3可以看出，各衍射曲线的基线较高，表明复合物中无定型结构居多，5种样品衍射曲线均在15.21°，17.28°和23.06°左右出现了衍射峰，为A型结晶结构的特征峰。将图3所得各衍射曲线进行处理，得出各衍射峰强度、相对峰面积和相对结晶度，列于表3。

图3 不同结晶温度时所得A型复合物的XRD图

从表3可以看出，结晶温度在55～80 ℃时，复合物的特征峰和尖锐程度均无显著变化，但超过80 ℃后，明显看到复合物的特征峰减弱，相对结晶度显著下降，原因可能是高温可以让B型复合物和色氨酸的活性增强，从而影响复合物的结晶结构[12]。根据A型复合物相对结晶度的计算可知，复合物制备的最佳结晶温度为60 ℃时，此时结晶度最大，为36.52%。

表3 不同结晶温度下所得复合物结晶度和相关衍射数据

2.2 最佳制备条件下所得A淀粉的结构表征

2.2.1 扫描电镜分析（SEM）

图4是马铃薯淀粉、B型微晶淀粉、空白对照组和直链淀粉-色氨酸复合物的扫描电子显微镜图。图4（a）显示，马铃薯淀粉呈椭球状和球状结构，似马铃薯外形，表面光滑，形状大小不一，无黏连现象。马铃薯淀粉经过酸解和重结晶后得到B型微晶淀粉，其颗粒球晶的尺寸相对均匀，直径约为2 μm。晶粒之间有轻微的黏附，这是因为酸解制得的微晶淀粉表面晶体结构不完整，解冻后部分晶粒之间发生融合。另外，由于溶液中冷冻和冰之间的挤压作用，一些淀粉颗粒的形状不平滑。图4（c）显示，空白对照组的淀粉样品表面粗糙，部分晶体之间有一些的黏连，可能是因为在干燥过程中淀粉链在晶体表面沉积以及部分淀粉表面结晶不完整，从而发生了形变。从图4（d）可以看出，直链淀粉-色氨酸复合物显示出直径约1 μm或更小的小球形结构，并且表面相对光滑。

图4 电子扫描显微镜

2.2.2 红外光谱分析（FT-IR）

图5分别是马铃薯淀粉、B型微晶淀粉和复合物的红外光谱图。从图5可以看出，3种淀粉样品有很多共同的红外吸收峰，是淀粉基团的红外特征吸收峰。3 380 cm-1附近出现的强而宽的吸收峰为淀粉中—OH基团的伸缩振动吸收峰，2 928 cm-1附近出现了明显的—CH2—的伸缩振动吸收峰，1 640 cm-1的峰是淀粉的醛基振动峰，1 000～1 300 cm-1处的吸收峰为C—O—C键的伸缩振动峰[13]。1 000 cm-1以下是指纹区，不代表官能团。通过红外光谱图可以看出3种淀粉样品的衍射峰位置并没有发生明显的变化，说明复合物中淀粉与色氨酸并没有形成新的化学键。复合物的衍射峰强度和尖锐程度均较高，可能是由于色氨酸放大了复合物红外散射的信号。

图5 红外光谱图

2.2.3 热重分析（TG）

分别对B型微晶淀粉和复合物进行热重分析，以研究淀粉样品的热稳定性，图6是B型微晶淀粉和复合物的TG和DTG图谱。表4是对应图6的热降解数值汇总。

图6 TG和DTG图

表4 B型微晶淀粉和复合物的热降解数据 单位：℃

淀粉的分解过程有三个阶段：第一个阶段是自由水分的蒸发；第二个阶段是样品快速分解；第三个阶段是样品分解完全阶段。从热重分析图中可知，当温度达到100 ℃左右，B型微晶淀粉与复合物的外延起始温度相同，当温度达到300 ℃左右，DTG图显示复合物在312.1 ℃达到峰值，此时的分解速率达到最大，这个阶段主要涉及淀粉的分解。B型微晶淀粉在305.2 ℃达到峰值，与复合物相比，其峰值温度较低，说明复合物可以提高淀粉的热稳定性。当温度超过350 ℃，淀粉样品完全分解，B型微晶淀粉与复合物的剩余量基本一致。

2.2.4 拉曼光谱（RAMAN）

图7为马铃薯淀粉、B型微晶淀粉和直链淀粉-色氨酸复合物的拉曼光谱图与局部拉曼光谱图。从中可以看出，马铃薯淀粉、B型微晶淀粉和直链淀粉-色氨酸复合物的拉曼光谱图很相似，因为3个样品都含有相同的化学键，即淀粉中特有的化学键。直链淀粉-色氨酸复合物的拉曼峰较弱，这是因为直链淀粉中含有色氨酸，形成的复合物更加无序，所以衍射峰的基线很高。与马铃薯淀粉和B型微晶淀粉相比，直链淀粉-色氨酸复合物在752.58 cm-1处有一个峰，此峰为色氨酸残基的特征吸收峰[14]。说明色氨酸与淀粉发生了复合。

图7 Raman图谱

3 结论

在色氨酸的存在下，以B型微晶淀粉为原料，采用冷凝回流方式制备复合物，并对影响复合物相对结晶度的因素进行研究。色氨酸存在下，制备复合物最佳结晶结构制备条件：B型微晶淀粉/色氨酸比例8∶1、乙醇体积分数39.39%、结晶温度60 ℃。并对结晶结构较好的样品通过XRD、IR和SEM进行结构表征。SEM分析表明，B型微晶淀粉为球状结构，而复合物为无规则颗粒结构。XRD测试结果显示，冷凝回流法制成的样品在15.19°，17.23°和23.00°左右处出现特征衍射峰，表明色氨酸存在下，B型微晶淀粉形成了明显的A型结构。IR分析表明，复合物中并没有新的化学键形成。热重分析显示，复合物的热稳定性高于B型微晶淀粉。拉曼光谱显示，直链淀粉-色氨酸复合物中有色氨酸的特征衍射峰，说明B型微晶淀粉与色氨酸形成了直链淀粉-色氨酸复合物。