高浓度CO2气调包装对冷藏草鱼品质的影响

程智蓁，张双其，杨庆伦，应晓国，于瑾*，胡金春*

1. 浙江海洋大学食品与药学学院（舟山 316022）；2. 浙江龙和水产养殖开发有限公司（衢州 324400）；3. 龙游县养殖业发展中心（衢州 324400）；4. 衢州市水产技术推广中心（衢州 324400）

草鱼（Ctenopharyngodon idellus）是世界上最重要的淡水鱼类之一，具有生长速度快、养殖方便、饲料利用率高、价格低廉、营养价值高等特点。根据2020年《中国渔业统计年鉴》[1]统计，2019和2018年草鱼的养殖产量在所有淡水养殖鱼类中均为最高，分别为5 533 083 t和5 504 301 t，2019年比2018年同比增长0.52%。草鱼市场需求量巨大且每年仍在不断增长，广受消费者欢迎。但是草鱼肉极易发生腐败，这是一个复杂的过程，涉及内外多种因素。主要分为两方面：一方面是由于草鱼肉的酸碱度为中性，蛋白质含量高，及鱼体内的酶促自溶；另一方面是由于微生物的作用而导致鱼肉品质下降，并伴有挥发性气味物质的变化。

气调包装是水产品保鲜技术之一，其采用具有气体阻隔性包装材料，将食品密封于一定比例的混合气体环境中，改变包装内食品的气体环境，从而达到抑菌及延长食品货架期的目的[2]。CO2能有效抑制微生物，特别是需氧微生物在对数生长期的生长速率。Sivertsvik等[3]总结CO2对细菌作用的4种机制：改变细胞膜功能（包括影响营养物质吸收）、直接抑制酶或降低酶反应速率、穿透细菌膜导致细胞内pH变化和直接改变蛋白质的理化性质。低温对微生物的生长有延缓作用，由于低温对微生物的直接作用的同时也能更好地溶解二氧化碳，如谢晶等[4]研究发现不同体积分数CO2气调包装中，80% CO2组的保鲜效果最佳，能有效延长凡纳滨对虾的冷藏货架期至8 d。高海[5]研究得出不同CO2、O2气体浓度包装方式对草鱼、三文鱼均能起到较好的保鲜鲜果，且起抑菌作用的主要为60%CO2，但有关高浓度CO2气调包装对草鱼的贮藏保鲜研究报道较少。

因此，以新鲜草鱼为研究对象，在100%体积分数的CO2气调冷藏条件下测定草鱼的微生物、各项理化指标及观察微观组织结构等的变化。研究高浓度CO2气调包装对草鱼冷藏过程中的品质影响，以期为高浓度CO2气调保鲜在草鱼等水产品中的应用、提高草鱼资源的利用率方面提供理论。

1 材料与方法

1.1 原料

新鲜活草鱼（购于舟山菜篮子市场，个体质量1.5～2.0 kg，原料运回实验室不超过30 min）。

1.2 主要仪器设备

SW-CJ-1F型超净工作台（苏州净化设备有限公司）；KDN-520型全自动凯氏定氮仪（邦亿精密量仪上海有限公司）；CR-10型色差仪（日本柯尼卡美能达公司）；HHS-21-4电热恒温水浴锅（上海博迅实业有限公司）；CF-16RN高速冷冻多用途离心机（日本日立公司）；FSH-2高速可调匀浆机（武汉格莱莫检测设备有限公司）；生物组织自动包埋机（湖北贝诺医疗科技有限公司）；ECLIPSE E100显微镜（NIKON）。

1.3 方法

1.3.1 原料处理及包装

鲜活草鱼，宰杀清洗去鳞、去内脏，分别取背部和腹部鱼肉，将鱼肉切块（鱼块质量35.0±0.5 g）后装入聚乙烯（PE）保鲜袋封装。鱼肉分成2组，1组为空气组，另外1组为100% CO2气调包装组。将鱼块装入PE包装袋后，真空充气包装机抽真空，利用钢瓶装CO2（纯度均为99.999 9%）通过配气装置进行配气，由进气口通入CO2气体，尾气直接排入空气中，包装好的鱼肉块放置于4 ℃冷藏。4 ℃贮藏期间，分别在0 d于（宰杀后未包装的鲜鱼）、0 d CO2气调处理及储藏1，3，5和7 d的样品测定相关指标。

1.3.2 菌落总数测定

按照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》[6]进行测定。

1.3.3 TVB-N含量测定

按照GB 5009.228—2016《食品安全国家标准食品中挥发性盐基氮的测定》[7]，利用全自动凯氏定氮仪法进行测定，每组重复3次，取平均值。

1.3.4 色差的测定

打开包装袋取出样品，将样品置于光源下，保持每次测定均在同一光源下进行。色差计经校准后，测定样品的色差值L*（亮度值）、a*（红度值）、b*（黄度值），每组对6个样品的外表面与正反两面进行测定取平均值。按照式（1）计算色差值（ΔE），分析色泽总变化。

式中：L0*、a0*、b0*分别为未包装处理鱼肉的亮度、红度和黄度值。

1.3.5 水分测定按照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》[8]，每组重复3次，取平均值。

1.3.6 汁液损失率测定

包装前将草鱼块进行称质量并记下初始质量，记为m0；试验时将草鱼块从包装中取出，用滤纸吸干表面水分后称质量，记为m1，每组重复3次，取平均值，计算如式（2）所示。

1.3.7 持水率测定

按Liu等[9]的方法稍作修改。称取5.0±0.5 g鱼肉，记为w1。用3层滤纸包装，放入50 mL离心管中，离心管底部放一团棉花。在4 ℃、5 000 r/min离心10 min后称其质量，记为w2。每组样品重复3次，求平均值，计算如式（3）所示。

1.3.8 蒸煮损失率测定

准确称取20 mm×20 mm×10 mm肉样，装入蒸煮袋中封好，在恒温水浴中加热至肉样中心温度至75 ℃，取出冷却至室温。用吸水纸吸干表面汁液后进行称量，每组样品重复3次取平均值，计算如式（4）所示。

式中：m2为蒸煮前鱼肉质量，g；m3为蒸煮后鱼肉质量，g。

1.3.9 微观组织结构观察

从样品中心部位顺纤维方向取3 mm厚，横截面约为5 mm×5 mm的样品，迅速投入4%多聚甲醛固定液中。固定后的样品石蜡切片脱蜡至水，依次将切片放入二甲苯Ⅰ 8 min-二甲苯Ⅱ 8 min-甲苯Ⅲ 8 min-无水乙醇Ⅰ 5 min-无水乙醇Ⅱ 5 min-85%酒精5 min-75%酒精5 min，自来水洗2 min；苏木素染色5 min，盐酸水溶液分化2 s，氨水水溶液返蓝15～30 s，水洗切片入95%的酒精脱水，入伊红染液中染色5～8 s。切片依次放入无水乙醇Ⅰ 30 s-无水乙醇Ⅱ 2.5 min-无水乙醇Ⅲ 2.5 min-二甲Ⅰ 2.5 min-二甲苯Ⅱ 2.5 min透明，中性树胶封片。用ECLIPSE E100显微镜放大100倍观察，图像采集分析。

1.4 数据分析与处理

所有数据至少重复3次，数据以平均值及方差表示。数据处理及作图采用OriginPro 9.1，SPSS 13.0统计分析软件。

2 结果与分析

2.1 菌落总数变化

水产品的腐败主要是由微生物作用引起的，菌落总数可以较好地反映鱼的腐败程度。由图1可以看出，随着贮藏时间延长，不同包装处理的草鱼菌落总数均呈增长趋势。草鱼的初始菌落为4.49 lg（CFU/g）。贮藏前期，菌落总数上升较为缓慢，这可能由于微生物还处在适应阶段，而第5～第7天微生物上升速度变快。根据《微生物检验与食品安全控制》国际食品微生物规格委员会规定[10]，鱼的菌落总数可接受水平限量值为5.69 lg（CFU/g），最高安全限量值为6.00 lg（CFU/g）。在第7天空气组的菌落总数达到6.21 lg（CFU/g），超过最高安全限量，而CO2处理组的菌落总为5.08 lg（CFU/g），在可接受水平内。另外，在整个贮藏期间CO2处理组的菌落总数也始终低空气组，说明CO2能够有效抑制微生物的生长繁殖，从而改善草鱼的鱼肉品质。

图1 草鱼在4 ℃气调包装贮藏期间菌落总数的变化

2.2 TVB-N值变化

TVB-N值是食品腐败的直观反映指标，与鱼类内源酶活性和微生物生长呈正相关。TVB-N值越大表明腐败程度越严重。从图2可以看出，在整个冷藏过程中，气调组的TVB-N值上升速度得到延缓，而空气组草鱼片的TVB-N值上升较快。空气组第0天，即新鲜草鱼片的TVB-N值为11.20 mg/100 g，0 d处理气调组的TVB-N值为10.92 mg/100 g。TVB-N≤13 mg/100 g为一级鲜度；TVB-N≤20 mg/100 g为二级鲜度。在冷藏第5天时气调组草鱼片的TVB-N值为12.60 mg/100 g，为一级鲜度，而空气组的TVB值达到18.43 mg/100 g，为二级鲜度。在冷藏第7天时气调组的TVB-N值为12.68 mg/100 g，几乎维持不变，仍维持在一级鲜度水平，而空气组的TVB-N值仍在上升，到第7天时达到29.17 mg/100 g，超过GB 2733—2015《食品安全国家标准鲜、冻动物性水产品》[11]规定的淡水鱼TVB-N限量值（≤20 mg/100 g），已不可食用，这与菌落总数结果一致。试验数据表明，高浓度CO2气调处理可以有效延缓TVB-N的增长速率，抑制草鱼片的腐败，从而延长草鱼片的货架期。这可能与气调包装中充入的CO2气体能够有效抑制大多数微生物的生长代谢，从而延缓因细菌生长繁殖导致的食品蛋白质分解而产生的氨及胺类等碱性含氮挥发性物质的产生有关[12]。

图2 草鱼在4 ℃气调包装贮藏期间TVB-N值的变化

2.3 色差变化

草鱼的色差变化是影响消费者可接受性的一个主要因素，在挑选产品时色泽也是最直观的原因之一。L*越大，表示越白；a*为正值表示偏红，负值表示偏绿；b*为正值表示偏黄，负值表示偏蓝；ΔE表示样品颜色的变化。尽管在试验过程中获得的L*（亮度值）、a*（红度值）、b*（黄度值）没有表现出显著的变化趋势，但是草鱼的色差值（ΔE）具有一定的变化趋势。色差值（ΔE）1.5～3.0为感觉到有点差异；3.0～6.0为显著性差异[13]。由图3可以得出，在第3天时气调组的色差为1.99，而空气组的色差值达到4.77，表现为显著差异。色差值（ΔE）6.0～12.0为极显著差异。在第7天时空气组的色差值为7.70，表现为极显著差异，而气调组的色差值为4.76，表现为显著差异水平。草鱼色差值（ΔE）呈逐渐升高趋势，这可能是由于在贮藏过程中鱼肉中蛋白质、脂质被氧化分解，蛋白发生变性，从而使鱼肉表面颜色发生改变。气调组的色差值在贮藏过程中低于空气组，表明高浓度的CO2能够在一定程度上抑制鱼肉的色泽发生变化，使草鱼保持较好的品质。这可能是由于CO2气调包装中缺少氧气，草鱼肌肉中的相关物质不能氧化所致。

图3 草鱼在4 ℃气调包装贮藏期间色差值的变化

2.4 水分变化

水分的高低直接影响食品的感官和口感[14]，反映新鲜度。由图4可知，新鲜草鱼的水分为77.92%，这与王雪峰等[15]的研究结果相似。随着贮藏时间延长，样品水分呈现下降趋势，空气组和气调组的降低程度分别为33.0%和10.6%。在贮藏第7天时空气组的水分明显下降为52.16%，明显低于CO2气调组的水分，为69.65%，贮藏过程中气调组的水分始终高于空气组，且下降速率低于空气组。其中的原因可能是酶反应与微生物生长繁殖需要大量水分，以及随着草鱼新鲜度下降使得鱼肉持水力下降，肌肉水分逐渐降低，而气调组中的CO2能够抑制部分微生物的生长，从而降低水分的需求量。这说明高浓度CO2处理能够有效抑微生物的繁殖和水分的丧失，改善冷藏过程中草鱼的保水性。

图4 草鱼在4 ℃气调包装贮藏期间水分的变化

2.5 汁液损失率变化

汁液损失率反映鱼体贮藏期间汁液的流失状况，汁液流失导致肉质的口感变差，产品变暗或无光泽，营养大量流失。由图5可以看出，空气组与CO2气调组的汁液损失率均呈上升趋势。空气组和气调组的汁液损失率分别从第0天的0.17%和0.36%上升到第7天的6.44%和5.58%。这是由于草鱼品质的劣变，使持水力下降，从而导致汁液流出。在冷藏前5 d时CO2气调组的汁液损失率总是高于空气组。这可能是因为在冷藏过程中CO2气体溶解于草鱼肉中，使得鱼肉蛋白质分子多肽链结合更为紧密，分子间距缩小，从而导致鱼肉持水力减弱，汁液流失。同时大量的CO2与草鱼表面流失的水分相溶，改变细胞膜的通透性，使细胞质大量渗出。在第7天时CO2处理组的汁液损失率低于空气组，并且上升速率延缓，这可能是CO2抑制微生物的生长繁殖，使得抑制脂肪与蛋白质的氧化变性作用要强于CO2溶于鱼肉所引起的汁液损失率，从而较好地维持草鱼品质。

图5 草鱼在4 ℃气调包装贮藏期间汁液损失率的变化

2.6 持水率变化

持水力表示在一定外力作用下，样品束缚自身或外加水分的能力[16]，鱼肉的嫩度和口感与持水力密切相关，当持水力下降时肉质也随之变硬，口感变差。如图6所示，随着冷藏时间延长，草鱼的持水力呈下降趋势。这是因为新鲜草鱼的肌肉组织和肌原纤维排列紧密且均匀，随着冷藏时间延长，鱼肉肌原纤维之间的空隙不断增加，同时组织结构发生断裂，保水性变差，因此持水力不断下降。在第0天时草鱼的持水率为76.8%，这与Liu等[9]的研究结果相似，CO2气调组的持水率为78.2%。在冷藏第7天时空气组和CO2气调组的持水力为58.13%和72.92%，它们的减少量分别为24.31%和6.75%。在整个周期中CO2气调组的持水率始终高于空气组。在第5～第7天的冷藏过程中，空气组的持水率急剧下降，而CO2气调组的下降速率已经开始延缓。这可能是因为冷藏期间，在鱼体内源酶与外源微生物发生共同作用下，鱼肉蛋白质降解，同时蛋白质的氧化不断发生，导致持水力下降。而CO2气调组使鱼体处于无氧条件，减缓蛋白质氧化速率和微生物生长繁殖，说明CO2气调处理的草鱼肉对其持水能力具有积极作用。

图6 草鱼在4 ℃气调包装贮藏期间持水率的变化

2.7 蒸煮损失率变化

蒸煮损失率是衡量肉制品熟制前后质量减少程度的重要指标。由图7得知，空气组的蒸煮损失率呈上升趋势，由第0天的24.39%上升到第7天的28.79%，且在冷藏0～7 d的过程中上升速率不断变大。原因可能是随着贮藏时间延长，微生物不断繁殖增长，蛋白质被降解，鱼肉的完整性受到破坏，使得蒸煮损失率上升。菌落总数的相似趋势也印证了这一说法。CO2气调处理组的蒸煮损失率呈不断下降的趋势，由第0天的23.76%下降至20.2%，且第5～第7天的下降趋势延缓。这可能是因为部分物质与水分的流失，同时蛋白质的溶解性也与蒸煮损失密切相关。蛋白质变性过程中特定的空间结构被破坏，生物学活性丧失，因而更易被蛋白酶催化水解，使得溶解度降低，蒸煮损失率上升。CO2气调组前期相较于空气组有较高的汁液损失率，因而在蒸煮过程中的汁液流失的较少，蒸煮损失率便较低。由于CO2气体对部分微生物生长活动的抑制作用，蛋白质的变性与水分的消耗逐渐减少，因此第5～第7天的变化延缓，这也与TVB-N值第5～第7天的趋势相吻合。

图7 草鱼在4 ℃气调包装贮藏期间蒸煮损失率的变化

2.8 微观组织结构变化

草鱼的微观组织结构可以反映其品质的变化。图8显示冷藏过程中草鱼横断面在100倍光学显微镜下的肌纤维形态。第0天新鲜组的草鱼的肌纤维膜状态良好，细胞结构完整。肌纤维之间的边界清晰且排列紧密整齐，间隙较小。随着贮藏时间的增加，空气组与CO2气调组草鱼的肌纤维间隙都不断增大，且肌肉表面结构变得疏松、破碎。第7天空气组可以明显看出肌肉细胞出现空洞，肌纤维的间隙增大、排列不均匀，与肌节分离，碎片数量多。对比空气组和CO2气调组可以看出，CO2气调组的肌纤维间隙较小，破裂程度低，组织状态更完整、致密。这可能与原纤维蛋白在微生物和酶的作用下降解变性有关，并且随着贮藏时间延长及微生物的生长代谢，氧化作用持续增强使得蛋白不断降解，组织结构开始松散。试验结果表明，CO2气调处理可以有效减缓蛋白质的氧化变性，从而较好地维持草鱼的肌肉结构。

图8 不同包装方式对草鱼横断面微观结构变化的影响（100×）

3 结论

通过空气与100% CO2气调包装草鱼并测定菌落总数、挥发性盐基氮（total volatile basis nitrogen，TVB-N）含量、色差、水分、汁液损失率、持水率和蒸煮损失率等指标及观察微观组织结构，结果表明，在相同的贮藏时间里，高浓度CO2气调包装处理组无论是在微生物指标还是理化指标及微观组织结构方面都要优于空气组。随着冷藏时间延长，草鱼的菌落总数、TVB-N值、色差值、汁液损失率均呈上升趋势，而CO2气调包装组整体值低于空气包组，且上升趋势较为缓慢。尤其是在冷藏第7天时，空气组的TVB-N值为29.17 mg/100 g，发生腐败变质，而气调组TVB-N值为12.68 mg/100 g，仍维持在一级鲜度水平。另外，在贮藏过程中，水分与持水率呈下降趋势，CO2气调包装组整体值高于空气包组，下降较为缓慢。结果表明，高浓度的CO2可以有效抑制草鱼体内大多数微生物的生长繁殖，延缓草鱼中蛋白质的氧化变性，保持良好的色泽及肌肉品质，从而改善草鱼的贮藏品质。总之，冷藏结合气调包装技术能有效延缓水产品变质，尤其是高浓度CO2气体能够有效延长草鱼肉货架期。