红枣富硒乳酸菌饮料的生产工艺

贺佳璇，杨欣，徐颖*，许牡丹

陕西科技大学 食品与生物工程学院（西安 710021）

红枣是鼠李科植物的成熟果实，富含维生素以及钙、磷、铁等矿物质[1-2]。红枣除鲜食外，可加工成多种制品，目前红枣的加工处于初级阶段，技术含量较低，精深加工的红枣产品较少，产品附加值偏低[3]。

饮食中添加硒，在国际上已受到广泛重视和认可[4]。食用有富硒乳酸菌的发酵食品，能达到补充人体每日所需硒元素的目的[5]。乳酸菌饮料是一类有发展潜力的食品，因为添加常见乳酸菌而风味独特，赋予饮料新的营养价值和保健功能[6-7]。利用乳酸菌制备猕猴桃乳酸菌饮料、石榴乳酸菌饮料和西瓜发酵乳饮料等，充分发挥了乳酸菌的优势，对丰富乳类饮品的市场和提升其经济价值都具有非常重要的意义[8-10]。

试验利用具有富硒能力的两株乳酸菌制备红枣富硒乳酸菌饮料，确定白砂糖接种量、红枣汁添加量、菌液接种量、发酵时间和发酵温度的比例范围。运用D-最优混料设计对配方进行设计并进行试验，分析优化结果选择最佳组合配方，为富硒乳酸菌饮料的研发提供理论及实践依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大荔冬枣，雨润农副产品采购中心，无损伤，成熟度一致；嗜热链球菌（BNCC 335885）、保加利亚乳杆菌（ZK-GIM 1.155），由实验室提供；亚硒酸钠，山东西亚化学工业有限公司；MRS培养基，北京奥博星生物技术有限公司。其他试剂均为常见分析纯。

1.2 仪器与设备

IRIS Intreid II电感耦合等离子发射光谱（美国Thermofisher公司）；FB-110X高压均质机（上海励途机械设备有限公司）；G030-7071榨汁机（国华电器有限公司）；722E型分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；HPPL3-600/3型超高压设备（天津市华泰淼淼生物工程技术有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 生产工艺流程

1.3.2 发酵工艺优化

将活化好的乳酸菌接种于含亚硒酸钠的液体MRS培养基中，于37 ℃培养24 h，以4 000 r/min离心5 min。菌体用无菌生理盐水洗涤3～4次，生理盐水重悬并调整菌数为1×109CFU/mL，制成菌悬液备用。

1.3.2.1 单因素试验

以白砂糖、红枣汁（料液比1∶3）、菌液接种量（菌液比1∶1）、发酵时间和发酵温度作为自变量，以总糖、总酸、总酚和感官评定作为评价指标，确定各成分的比例范围。

1) 白砂糖添加量对红枣富硒乳酸菌饮料的影响。在脱脂奶粉（g）与水（mL）比例12%、红枣汁添加量70%、菌液接种量3%、发酵时间36 h和发酵温度37 ℃的条件下，白砂糖添加量分别为0，2%，4%，6%和8%，考察白砂糖添加量对红枣富硒乳酸菌饮料品质的影响。

2) 红枣汁添加量对红枣富硒乳酸菌饮料的影响。在白砂糖添加量4%、脱脂奶粉（g）与水（mL）比例12%、菌液接种量3%、发酵时间36 h和发酵温度37 ℃的条件下，红枣汁添加量分别为40%，50%，60%，70%，80%和90%，考察红枣汁添加量对红枣富硒乳酸菌饮料品质的影响。

3) 菌液接种量对红枣富硒乳酸菌饮料的影响。在白砂糖添加量4%、脱脂奶粉（g）与水（mL）比例12%、红枣汁添加量70%、发酵时间36 h和发酵温度37 ℃的条件下，菌液接种量分别为1%，2%，3%，4%，5%和6%，考察菌液接种量对红枣富硒乳酸菌饮料品质的影响。

4) 发酵时间对红枣富硒乳酸菌饮料的影响。在白砂糖添加量4%、脱脂奶粉（g）与水（mL）比例12%、菌液接种量3%、红枣汁添加量70%和发酵温度37 ℃的条件下，发酵时间分别为6，12，18，24，36和48 h，考察发酵时间对红枣富硒乳酸菌饮料品质的影响。

5) 发酵温度对红枣富硒乳酸菌饮料的影响。在白砂糖添加量4%、脱脂奶粉（g）与水（mL）比例12%、菌液接种量3%、发酵时间36 h和红枣汁添加量70%的条件下，发酵温度分别为36，38，40，42，44和46 ℃，考察发酵温度对红枣富硒乳酸菌饮料品质的影响。

1.3.2.2 D-最优混料试验设计

根据单因素试验得到红枣汁、白砂糖和菌液各成分的比例范围，以感官评定为指标，利用D-最优混料设计对乳酸菌饮料配方进行试验设计。应用Design-Expert 8.0统计软件对试验数据进行回归拟合分析，选出预测模型并得到回归方程。

1.3.2.3 红枣汁添加量、白砂糖添加量和菌液接种量三种因素交互影响分析

在D-最优混料设计试验中，各因素的变化对指标的影响可以通过响应面图和等高线图反映。

1.3.2.4 配方的优化及验证试验

利用软件进行优化，得到组合配方，分析优化结果选择最佳配方。对配方进行验证试验，判断试验值与预测值的符合度。

1.3.2.5 指标及检测方法

总酸测定，直接滴定法。总糖测定，斐林试剂法。总酚测定，Folin-Ciocalteu法。感官评定，感官评分组由15位感官评价员组成，对每份样品进行感官分析评定，每位评定小组成员进行过至少一次感官评定培训，去掉最高分和最低分，以平均分为综合评分结果，评分原则及指标如表1所示。

表1 红枣富硒乳酸菌饮料感官评分标准

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与讨论

2.1.1 白砂糖添加量对红枣富硒乳酸菌饮料品质的影响

白砂糖作为乳酸菌发酵所需的碳源，添加量过少，乳酸菌会生长迟缓，产品香味缺乏；添加量过多，使口味过甜[11]。表2得出：4%左右的白砂糖添加量不仅产品的甜度适中，产品口感较好，感官评定分数较高，而且乳酸发酵速度相对较快，可以节约发酵时间。随着白砂糖添加量的增加，总糖呈现上升的趋势。白砂糖添加量在0～4%之间时其感官评分呈上升趋势。添加量4%时，感官评分达到最高，之后降低。当白砂糖添加量为4%时，总酚浓度最高，为9.19±1.08 μg/mL，因此选取白砂糖添加量3%～5%。

表2 白砂糖添加量对乳酸菌饮料品质的影响

2.1.2 红枣汁添加量对红枣富硒乳酸菌饮料品质的影响

由表3可得：经过感官品评，以70%红枣汁和30%脱脂牛奶混合制备的乳酸菌饮料，口感、风味最优。当红枣汁添加量为70%时，产品红枣果香与奶香协调，口感柔和细腻，平均感官评分最高，为80分，总酚浓度也最高，为8.94±0.78 μg/mL。随着红枣汁添加量的变化，总糖浓度没有明显变化。当红枣汁添加量为70%时，总酸浓度为0.52±0.09 g/100 mL，酸度适宜，酸度过高或过低均会影响滋味。因此，该试验的最佳红枣汁添加量为70%，选取红枣汁添加量范围70%～74%。脱脂牛奶添加过多，风味不协调，生产成本增加，添加过少，则奶香味过淡。枣汁能够促进乳酸菌生长，使活菌数增多，红枣汁与脱脂牛奶混合发酵制备发酵乳饮料，使制得的红枣乳酸菌饮料既具有乳酸香味，又具有枣汁的果香。

表3 红枣汁添加量对乳酸菌饮料品质的影响

2.1.3 菌液接种量对红枣富硒乳酸菌饮料品质的影响

接种量过低时，发酵时间延长，产酸量较低，容易受到杂菌污染；接种量过高时，发酵速度虽加快，但细胞容易衰老，出现自溶现象[12]。由表4可知：随着接种量的增多，感官评分先升高后缓慢降低，当菌液接种量为3%时感官评分达到最高；接种量越大，总糖浓度越低，说明乳酸菌利用糖为底物进行发酵产酸，当红枣汁中营养成分较多时，接种量越多，发酵液中活菌数越多，最终发酵液的总酸浓度也就越高；当菌液接种量为3%时，总酚浓度最高，为9.49±1.21 μg/mL。发酵过程中部分结合酯型酚酸会分解成为游离型酚酸，所以总酚在一定范围会有所增高，故选取接种量范围3%～5%。

表4 菌液接种量对乳酸菌饮料品质的影响

2.1.4 发酵时间对红枣富硒乳酸菌饮料品质的影响

发酵时间的长短会直接影响到发酵产品口感和风味。由表5可知：随着发酵时间延长，总糖浓度持续降低，感官评分先升高后降低缓慢，发酵24 h时其感官评分达到最高，总酚浓度为8.21±0.45 μg/mL，说明产品的品质最优。酸度随发酵时间的延长而升高，24 h时总酸浓度为0.52±0.06 g/100 mL，之后增加迅速，酸度过高和酸度不足均会影响乳酸菌饮料的口感和风味。因此，发酵时间选择24 h。

表5 发酵时间对乳酸菌饮料品质的影响

2.1.5 发酵温度对红枣富硒乳酸菌饮料品质的影响

由表6可知：发酵温度在36～38 ℃之间时，随着温度的升高感官评分逐渐上升，38 ℃时达到感官评分最高，随后降低；当温度为38 ℃时，总酸浓度为0.66±0.09 g/100 mL，酸度适宜。发酵温度的过高或过低均会影响乳酸菌的生长繁殖，使产酸量降低。随着发酵温度的升高，总酸和总糖的浓度变化不大。发酵温度38 ℃最适合乳酸菌的生长繁殖，能快速启动乳酸发酵，减短发酵周期，是红枣乳酸菌饮料发酵最适温度，所以选取的发酵温度38 ℃。

表6 发酵温度对乳酸菌饮料品质的影响

通过分析白砂糖添加量、红枣汁添加量和菌液接种量对乳酸菌饮料的影响，结果表明乳酸菌饮料中白砂糖添加量3%～5%、红枣汁添加量70%～74%、菌液接种量3%～5%时能体现乳酸菌饮料良好品质，发酵最适时间和温度分别为24 h和38 ℃。

2.2 D-最优混料设计优化结果与分析

2.2.1 感官回归模型选择

表7所示为混料设计方案以及感官评分的预测值和实际值。对试验数据分别进行线性回归拟合和二次、三次多项式回归拟合。将感官评分作为响应值Y，最终得出回归模型：

表7 红枣富硒乳酸菌饮料混料试验设计方案

Y=-25.09A+68.42B+52.93C+185.94AB+228.12AC+55.62BC+264.15A2BC+426.69AB2C-730.16ABC2

2.2.2 方差分析

由表8可知：模型的F值为44.44，且p＜0.01，说明该回归模型是极显著的，同时失拟项的F值为0.84，相关p值为0.485 3，表明失拟项不显著，决定系数R2为0.980 7，表明感官评分结果的变异中，由自变量引起的占比98.07%。以上结果证明该模型能反映出各参数之间的关系，可以用来预测红枣富硒乳酸菌饮料的感官评分。

表8 回归模型方差分析表

2.2.3 因子间交互影响分析

图1为白砂糖添加量、红枣汁添加量、菌液接种量对感官评分影响的等高线图和响应面图。等高线图的形状可以反映各因子之间交互作用强度，等高线图呈圆形说明交互作用不显著，等高线图呈椭圆说明因子之间交互作用显著[13]。从图1可以看出，3个因子的等高线图呈椭圆型，响应面图均呈向上凸的曲面，说明三者间具有一定的交互作用，感官评分存在最大值。

图1 三种因子对感官评分影响的等高线图及3D响应面图

2.3 验证试验

采用Design-Expert进行数据分析，得到接近最大感官评分的2种配方，且给出每个配方感官评分的预测值，结果如表9所示。当白砂糖添加量为4.02%，红枣汁添加量为72.22%，菌液接种量为3.76%时，预测的乳酸菌饮料的感官评分最大，为89.32分；当白砂糖添加量为4%，红枣汁添加量为72%，菌液接种量为4%时，预测的乳酸菌饮料的感官评分为88.65分。按上述优化的配方制备乳酸菌饮料，进行感官评分并得到实测值。验证试验结果表明，第一组配方的红枣富硒乳酸菌饮料的感官评分最高，为88分，第二组为87分，与预测的结果相一致，说明得到的回归模型有较高的拟合度。但两组配方试验结果之间无显著差异，考虑到后来的试验和生产，在此试验结果下选择更易于试验和生产的第二组配方。

表9 红枣富硒乳酸菌饮料配方优化结果

将制备得到的红枣富硒乳酸菌饮料取10 mL，烘干后用强酸消化，用0.45 μm的微孔滤膜过滤，用ICP测定样品的硒浓度，红枣富硒乳酸菌饮料中硒的浓度为0.50 μg/mL，成人每日饮用100～200 mL该饮品可摄入50～100 μg硒，充分满足人体每日对硒的生理需要。

3 结论

通过研究白砂糖添加量、红枣汁添加量、菌液接种量、发酵温度和发酵时间对红枣富硒乳酸菌饮料品质的影响，确定了各因素的范围：白砂糖添加量3%～5%、红枣汁添加量70%～74%、菌液接种量3%～5%、发酵温度38 ℃、发酵时间24 h。D-最优混料设计优化得到的红枣富硒乳酸菌饮料的配比为白砂糖添加量4%、红枣汁添加量72%、菌液接种量4%，预测的乳酸菌饮料的感官评分为88.65分。验证试验结果表明，最优配方的红枣富硒乳酸菌饮料的感官评分为87分，与预测的结果相一致，红枣富硒乳酸菌饮料中硒的浓度为0.50 μg/mL，能够满足成年人体对硒的生理需求。