探讨实时荧光定量PCR仪用于流感病毒检测的效果分析

张月新 天津市东丽区疾病预防控制中心检验科 （天津 300300）

内容提要：目的：探讨实时荧光定量PCR仪器对流感病毒检测效果。方法：选择2019年6月～2020年6月本中心采集的流感病毒咽拭子及血液样本各116份，根据检测方法将其分为三个不同的组别，分别用实时荧光定量PCR仪、普通PCR仪、酶标仪进行检测、最终采用病毒分离培养法进行验证。结果：本次实验研究结果显示，使用实时荧光定量PCR仪检测流感病毒的灵敏性和准确度要比传统血清学检测的灵敏性和准确度都高。结论：虽然流感病毒检测中使用实时荧光定量PCR仪需要消耗高一些的成本，但使用此种方法可以节省检测的人力，并缩短人员的检测时间，可以根据PCR检测的特点，将其使用于公共场所从业人员的流感病毒快速筛选工作中，从而帮助更多的人及时检测病原，最终展开针对性的治疗方案。

流感病毒其属于一种RNA的病毒，呈现出丝状或者球形的状态[1]。流感病毒可以分为甲型流感病毒、乙型流感病毒以及丙型流感病毒。流感病毒主要是由凝血素以及神经氨酸酶共同组成，该病毒具有一定的抗原性，极易发生变异[2]。甲型流感病毒则主要包含H以及N的变异，H有16个亚型，而N有9个亚型[3]。因此，甲型流感病毒也又分为很多不同的亚型疾病。为了显著降低患有甲型流感病毒的发生率，需要建立一个快速准确的检测方法，从而为更多的甲型流感病毒患者提供有效的诊断以及治疗，并实现全球流感疾病发生趋势的预见性作用[4]。基于此，本文选择2019年6月～2020年6月本院采集的流感病毒咽拭子样本及血液样本各116例，根据检测方法将其分为三个不同的组别，分别用实时荧光定量PCR仪、普通PCR仪、酶标仪进行检测、最终采用病毒分离培养法进行验证，主要研究实时荧光定量PCR仪在流感病毒核酸检测中的应用，以期为大家提供部分建议。

1.资料与方法

1.1 一般资料

选择2019年6月～2020年6月本院采集的流感病毒咽拭子样本及血液样本各116例，根据检测方法将其分为三个不同的组别，分别用实时荧光定量PCR仪、普通PCR仪、酶标仪进行检测、最终采用病毒分离培养法进行验证。参与实验的样本均在24h内送至实验室进行检查。无法在24h内进行检测的咽拭子样本需保存在零下70°C的环境中，血液样本保存需保存在零下20°C的环境中。

1.2 方法

使用生物安全柜、高速离心机、全自动实时荧光定量PCR仪器、PCR仪、电泳仪、酶标仪、旋涡振荡器、核酸提取仪、核酸提取试剂、无核酸离心管、培养液、流感病毒核酸检测试剂盒。

A组实施荧光定量PCR法：根据核酸提取仪说明书以及扩增试剂盒的方法进行实验。

使用流感病毒核酸检测试剂盒，反应体系主要由反应液、逆转录酶、引物探针组成，全部反应体系配置情况，需以试剂盒的说明书为主。扩增步骤为：第一步，50°C进行30min→95°C进行5min，此步骤完成一个循环；第二步，95°C的环境下进行10s，然后在55°C环境下进行40s，同时在55°C的环境下收集荧光。如此反复45个循环，最后进行荧光数据分析，从而判定是否为流感病毒，且同时完成病毒分型。

B组实施RT-PCR方法：核酸提取使用同实时荧光定量PCR法相同的试剂和步骤，扩增选用普通RT-PCR反应试剂盒，使用普通PCR仪进行扩增，扩增过程同样为50°C进行30min→95°C进行5min，此步骤完成一个循环。然后95°C的环境下进行10s，在55°C环境下进行40s，此过程重复45个循环。然后收集扩增产物，加染色剂进行琼脂糖凝胶电泳，进行条带分析。通过与对照条带的比对进行阴阳判断，并同时完成分型。

C组实施使用酶标仪进行血清学检测。将血液标本进行离心后取上清液，使用流感病毒抗体检测试剂盒进行检测，反应步骤遵照试剂盒使用说明书进行，最后使用酶标仪进行检测。

根据流行感冒诊疗方案，对流感病毒实施分离鉴定培养，并将10000u/mL双抗置入样本病毒内，进行采液，并对细胞病理变化进行详细的观察，最终通过红细胞凝集实验对病毒培养液进行检测，当实验滴度达到1:16的时候，或者超过这一比例的细胞培养液时，需要使用红细胞凝集抑制实验对相关的亚型标准血清进行鉴定。检测人员需要在样本中适当添加双抗接种细胞，并观察细胞的变化。同时结合细胞病变以及细胞凝集的实际情况进行判断。若红细胞凝集实验符合细胞培养，可以采用亚型标准血清进行流感病毒的分型。并以病毒培养的结果为最终依据，判断以上三种方法的检出率及准确性。

1.3 统计学分析

本次临床实验结果数据使用统计学软件SPSS 23.0对其进行相关的统计以及分析，阳性检出率使用计算型指标以[n(%)]表示，并使用χ2值对其进行检验。P<0.05为两组具有显著性差异。

2.结果

本次实验研究的检测结果显示，使用实时荧光定量PCR仪检测出样本的阳性数量为57，阳性检出率为97.28%。实时荧光定量PCR与普通RT-PCR方法检测的结果一致，可以互为验证，但是使用荧光定量PCR仪更省时，操作也更简单，同时因为是在封闭的反应管中进行扩增同时完成检测和数据分析，大大减少了扩增产物泄露污染实验室的风险。使用酶标仪进行的血清学检测方法阳性检测数量为50，阳性检出率为86.21%，其中，通过与病毒分离培养结果的比对验证，有2例标本排除了流感病毒阳性，为假阳性结果。可见，血清学的方法虽然快速、方便、操作简单，但是干扰因素比较多，容易出现假阳性和漏检的情况。使用统计学计算显示，χ2=5.9024，P<0.05。由此可见，PCR检测方法的阳性检出率和准确性要比血清学实验的阳性检出率和准确性都高。使用荧光定量PCR仪检测因为操作简单、快速、准确、安全等一系列优点，可以作为流感检测的首选方案。

3.讨论

3.1 流感病毒分析

流感病毒可以通过患者的飞沫、人与人之间的接触或者和被污染的物品接触进行传播[5]。流感患者的临床表现为寒战、肌肉酸痛、干咳等，且每年流感的发生率较高，甚至严重时会发生死亡，对于婴幼儿以及老年人群的身体产生严重危害。

3.2 实时定量PCR分析

实时定量PCR分析在对病毒的检测、病毒感染的预防、诊断和治疗以及病毒疫苗的质量控制等方面都有重要作用。实时定量PCR是实验室病毒检测中最常用的方法。该方法具有灵敏度高、检测速度快、污染小等优点。实时定量PCR技术是一种基于常规聚合酶链式反应技术的高灵敏度定量PCR技术。较传统PCR方法，提高了反应的特异性和自动化程度，有效地解决了PCR污染问题，实现了检测质量的飞跃。在医学诊断和环境监测等诸多领域中得到了广泛的应用。

聚合酶链式反应是分子生物学中常用的实验方法。它在病原体检测和疾病诊断等方面有着广泛的应用。基于传统PCR技术在基因数量上的不足，1996年提出了实时荧光定量PCR（RQ-PCR）。这一技术不仅实现了由定性PCR向定量PCR的飞跃，而且其简单性、特异性和敏感性，以及高通量的潜力和新科学的不断引入，使得实时荧光定量PCR技术成为检测基因水平的基准技术[3]。

实时荧光定量技术基础在于：实时定量PCR技术与传统PCR技术相比，基本原理相同，主要区别是其定量体系。将荧光染料或荧光基团加入到PCR反应体系中，使之具有特定波长。利用荧光信号，可对整个聚合酶反应过程进行实时自动检测和监测。测量到的信号将被用来作为聚合酶链反应周期荧光阈值的坐标。

3.3 实时定量PCR分析的定量方法

实时荧光定量PCR检测技术是一种可以进行定量检测的基因扩增的PCR技术，此种检测技术的主要原理是在PCR系统中，添加一些荧光染料或者荧光分子标记的寡核苷酸链，通过物质和PCR相结合产生特定的物质，且此种物质在紫外线的刺激之下，可以发生特定的荧光。荧光标记的探针汇总主要包括水解探针和杂交探针[6]。

而实时荧光定量PCR的定量方法中主要包括：（1）绝对的定量措施，通过构建合理的基因序列标准，并对其进行一系列的定量检测工作，将标准品进行合理的稀释工作之后，可以获得多个不同稀释之后的Ct数值。（2）相对定量：其主要是检测人员不需要做一些额外的标准曲线，其具有简便、省时等优势。

3.4 实时荧光定量技术在病原DNA检测中的应用

实时PCR检测病原DNA，不仅能确定病原DNA的性质，还能定量检测病原DNA含量，为临床诊断提供有力的依据。当前，实时荧光定量PCR技术已应用于乙型肝炎病毒DNA、猪内源性逆转录病毒、EB病毒等多种病原体的检测。

流感病毒是粘性病毒阳性家族的代表。这就是所谓的流感病毒属于单负链RNA病毒，易导致上呼吸道感染。流感病毒可感染许多动物，也是人类主要的病原菌。流感病毒按照其H、N抗原可分为若干亚型。流行性感冒的临床症状很容易与普通感冒混淆。常规的实验室诊断方法费时费力、技术要求高，不能及时诊断。常用的诊断方法有：血清学诊断、病毒分离及特异性抗体检测。但是，当新型流感病毒引发流感流行时，由于无法在短时间内得到病毒株的抗体，因而无法实现血清学检测。所以，开展病毒核酸检测技术的研究，对早期诊断病原体有重要意义[7,8]。

即时多聚酶链式反应是利用核酸高度扩增的聚合酶链反应和探针技术的高度特异性而实现的飞跃（实时定量的聚合酶链反应）。该方法克服了常规PCR法检测流感病毒易被污染、假阳性率高的缺点，且具有较高的特异性、灵敏度和操作自动化等优点，可用于流感病毒的快速检测。该方法操作简便，不需特殊仪器，20min内可迅速得到检测结果，操作人员培训易于掌握。为快速筛查提供了有效手段。但是它的阳性率很低，容易产生假阴性。利用荧光PCR技术实时检测PCR扩增反应中各循环产物的荧光信号，可实现对初始模板的定量和定性分析。一种荧光化学物质被引入到实时荧光聚合酶链反应中[9-11]。多聚酶链式反应的产物随着聚合酶链反应的不断积累，荧光信号强度呈等比例增加。PCR产物可通过实时动态监测来定性、定量地监测。该方法具有特异性强、灵敏度高、快速、简便、经济、经济等优点。流感病毒检测可以在3～4h内完成，可以实现封闭式PCR检测，克服了普通PCR易污染的缺点。试验中，两种用于探针标记的荧光素FAM的发射波长相距较远，以避免由于接近荧光波长所引起的相互干扰，保证了实验的特异性和灵敏度。在全球流感疫情日趋严重的情况下，口岸传染病检测的要求也越来越高。该方法能快速有效地检测出流感病毒[12,13]。

甲型流感病毒通用型引物探针，对于其他非甲型流感病毒不存在任何交叉检验反应。使用逆转录重组酶介导核酸扩增技术反应体系中最低的可检测数量为100copies。逆转录重组酶介导核酸扩增技术检测甲型流感病毒的特异性以及敏感性都比较好。因此，将实时荧光定量PCR应用于流感病毒核酸检测中，具有较高的检测意义。结果显示，PCR阳性检出率（97.28%）高于血清学实验组的阳性检出率（86.21%），且P<0.05。

综上所述，使用RT-PCR，尤其是实时荧光定量PCR检测流感病毒具有较高的应用价值。