补体系统对骨偶联作用机制的研究进展*

李芳瑜,刘晓辉,崔 舜

华中科技大学同济医学院附属协和医院风湿科,武汉 430022

骨骼与免疫系统两者之间互相联系又相互作用,共享许多调节分子,这种关系近年称之为骨免疫学[1]。由成骨细胞分泌的核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL),也称肿瘤坏死因子相关激活诱导细胞因子(TNF-related activation-induced cytokine,TRANCE),属于肿瘤坏死因子超级家族成员,可介导破骨细胞形成,激活成熟破骨细胞,促进骨吸收[2]。RANKL是明确连接这两个系统的最重要的细胞因子之一,越来越多的证据表明RANKL在免疫系统中发挥多种作用,包括淋巴结发育和胸腺上皮细胞分化[1]。由免疫系统分泌的促炎细胞因子,如白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、IL-6、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)可以增强破骨细胞的活性,促进骨吸收[3]。补体系统是固有免疫系统的重要成分,与骨骼系统也有着紧密的联系,补体C3、C5、补体受体C3aR、C5aR以及膜结合调节蛋白CD46、CD55、CD59在人骨髓间充质干细胞、成骨细胞以及破骨细胞等中均有表达[4]。

在骨代谢过程中,通过成骨细胞介导的骨形成与破骨细胞介导的骨吸收来维持骨骼矿化平衡及自身结构的完整,此过程即骨重塑(bone remodeling)[5-6]。在骨重塑中,破骨细胞所介导的骨吸收需要由成骨细胞进行填补以维持骨质、骨量和骨结构的稳定,这一在时间和空间上协调的成骨细胞和破骨细胞精确平衡又称为骨偶联(bone coupling)[7]。骨偶联失衡,可导致骨代谢性疾病,如骨质疏松症、骨硬化症和炎症性骨侵蚀[8]。研究表明,补体可以通过直接和间接途径影响破骨细胞的生成与分化[9]。补体还可以调节炎症环境中成骨细胞对炎症的反应,并通过改变成骨细胞增殖分化过程中所产生的细胞因子影响破骨细胞的增殖[10]。本文综述了补体系统与骨偶联之间的作用关系,旨在揭示补体系统对骨偶联的影响及作用机制,为骨代谢相关疾病的治疗提供新思路。

1 补体系统影响骨偶联的证实

补体系统对骨偶联的影响,是由Stao团队首次证实,Sato等[11]早期的研究表明,当用1,25-(OH)2-VitD3处理小鼠骨髓基质细胞和原代成骨细胞时,培养液中补体C3逐渐增加,并且C3可以促进破骨细胞分化。这是首次揭示补体在骨代谢过程中充当“偶联因子”的作用,也为后期补体在骨偶联中的作用机制研究奠定了基础。小鼠模型骨稳态和骨转化的研究进一步证实了补体在骨结构中的调节作用。研究显示,C5aR1基因敲除小鼠和C5aR2基因敲除小鼠均显示出高骨量表型,并且伴随着骨小梁中破骨细胞数量的减少[12]。在骨软骨活检中,研究发现补体表达于骨髓、少数软骨下骨细胞和软骨细胞中,其中补体C3表达最多。基因表达分析显示补体在软骨细胞和滑膜细胞中均有表达[13]。补体系统可以通过影响骨偶联,参与骨代谢的调控。

2 补体系统影响骨偶联的机制

2.1 补体系统的激活

补体是先天免疫的主要参与者之一。补体系统的激活可以通过三种不同的途径,即经典途径、替代途径和凝集素途径。三种激活途径都汇聚到一条共同的途径,导致产生相同的生物活性分子:C3b调理素促进病原体吞噬,C3a和C5a过敏毒素诱导血管扩张和吞噬细胞募集到炎症部位,引发急性炎症反应。补体还通过产生促进细菌吞噬作用的C3b调理素和形成导致病原体直接裂解的膜攻击复合物(membrane attack complex,MAC)参与炎症。因此,补体在急性炎症及其消退中起着有益的作用[14]。然而,补体激活可能会导致炎症介导的组织损伤,从而产生对组织不利的影响。由组织代谢(软骨和滑膜)引起的补体通路的激活,将导致软骨破坏和滑膜炎症,与骨性疾病的放射学严重程度相关[15]。

2.2 补体对成骨细胞的影响

关于补体对成骨细胞的调节作用,研究发现C5aR的m RNA在成骨分化过程中显著上调,且C3a、C5a与炎症因子IL-1β共同刺激可显著诱导成骨细胞分泌IL-6和IL-8,这表明补体调节炎症环境中成骨细胞对炎症的反应[4]。在补体激活骨髓间充质干细胞诱导成骨分化实验中,通过诱导第14天茜素红染色,发现C3a和C5a均以C3aR和C5aR特异性方式加速钙化[16]。为了进一步探究补体如何促进成骨细胞分化,调节骨偶联,研究者建立了成骨细胞和成熟破骨细胞的共培养体系,发现了补体介导成骨细胞与破骨细胞之间的偶联途径。研究者首次从成熟破骨细胞的条件培养液(conditioned medium,CM)中纯化出与补体C3匹配的肽,并检测出在破骨细胞分化过程中,C3逐渐增加,且C3生物活性片段C3a可以刺激成骨细胞分化。当破骨细胞中的C3基因表达被敲低时,破骨细胞的CM不能刺激成骨细胞的分化,在存在C3aR拮抗剂的情况下,CM会抑制成骨细胞的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的活性。体外实验表明,小鼠在卵巢切除术(ovariectomy,OVX)或RANKL注射的高骨转换状态下,骨中C3基因表达增加,然而每天使用C3aR拮抗剂阻断C3a的作用,将导致骨衰减增加,骨形成减少并加剧骨质流失[17]。这些研究均揭示,CM中的C3a可以增强成骨细胞ALP活性,且C3a可以介导骨骼高转换模型中骨吸收与形成的偶合。

2.3 补体对破骨细胞的影响

补体对破骨细胞具有重要的调节作用。研究发现,将抗C3抗体添加到骨髓培养物中不仅抑制了破骨细胞的出现,还抑制了单核巨噬细胞和骨髓基质细胞的生长,且在培养初期加入抗C3抗体时,这种抑制作用最强,表明补体C3是破骨前体细胞增殖和早期分化所必需的成分[18]。补体C3以及补体受体C3aR、C5aR基因敲除小鼠的骨髓基质细胞,诱导产生的破骨细胞以及巨噬细胞集落刺激因子均明显减少,进一步验证补体对破骨细胞增殖分化的重要性;同时,研究发现在破骨细胞分化过程中,骨髓基质细胞通过补体激活的替代途径局部产生C3a和C5a,调控破骨细胞的分化[10]。目前,关于补体如何促进破骨细胞形成,有直接和间接两种途径。C3a和C5a对破骨细胞生成具有直接调节作用,即在不存在M-CSF和RANKL的情况下用C3a和C5a进行破骨细胞刺激实验,发现即使没有RANKL与M-CSF,C3a、C5a也会显著诱导破骨细胞形成[19]。此外,当C3基因敲除小鼠的骨髓基质细胞用1,25-(OH)2-VitD3刺激后,M-CSF表达以及RANKL/OPG的比率相对于野生小鼠降低。MCSF的表达和RANKL/OPG比率的增加是破骨细胞形成必需因素,表明补体通过间接作用影响破骨细胞的形成。

2.4 补体通过特异性受体发挥作用

补体受体存在于不同细胞膜表面,能与补体激活过程中所形成的活性片段相结合,介导多种生物学效应。在骨偶联中,补体可通过其特异性受体在多种骨细胞中发挥作用。体外研究显示,破骨细胞能表达补体受体C3aR、C5aR1和C5aR2,还能够通过将C5切割成其活性形式C5a来激活补体[4]。来源于间充质干细胞的成骨细胞,表达补体受体C3aR和C5aR,并且可以在其细胞表面局部产生C3a和C5a[20]。C3aR属于细胞膜表面的G蛋白偶联受体,在B细胞和T细胞上表达,参与调节T细胞介导的免疫反应。C5a/C5aR1相互作用与炎症性疾病的发病机制有关[21]。

补体C3与其受体C3aR结合可以影响M-CSF以及RANKL/OPG表达,补体C5a也可参与RANKL/RANK/OPG下游信号丝裂原活化蛋白激酶MAPK(mitogen-activated protein kinase,MAPK)的基因调节[22]。MAPK是信号从细胞表面传导到细胞核内部的重要传递者,在巨噬细胞和嗜中性粒细胞中以C5a依赖性方式激活MAPK,抑制MAPK信号,可阻断巨噬细胞系向破骨细胞分化[23]。此外,证据显示C5aR1可刺激中性粒细胞引起ERK1/2和MAPK通路上重要的信号分子P38磷酸化从而产生IL-6等细胞因子,促进破骨细胞的生成,从而增加骨吸收[22]。

2.5 补体可能通过共同受体发挥作用

补体除了作用于自身特异性受体外,越来越多的研究发现补体还可以作为共同配体作用于其他细胞膜受体,如晚期糖基化终产物的受体RAGE(receptor for advanced glycation end products,RAGE)。RAGE是一种涉及多种慢性炎症状态的多配体模式识别受体,在骨髓间充质干细胞、成骨细胞及破骨细胞均有表达[24]。RAGE及其配体,不仅在固有免疫反应中起重要作用,对破骨细胞的分化、成熟以及骨再建也有调节作用[25-26]。补体活性片段C3a即为RAGE的高亲和性配体之一[27]。由此推测,作为高亲和配体的C3a也可能通过RAGE激活下游信号通路进而调节骨偶联。然而,C3a-RAGE结合效应在机制和治疗靶点方面仍有待进一步探究。

综上所述,补体调控骨形成信号通路中的重要信号分子,调节骨偶联相关多种细胞因子,参与骨偶联过程中成骨细胞和破骨细胞的生成、分化、增殖,对维持骨骼矿化平衡和自身结构完整发挥重要作用。

3 补体对骨代谢相关疾病的治疗前景

早期研究已经表明,补体是先天性和获得性免疫应答的重要组成部分,三种补体激活途径中产生的裂解产物均可引起炎症和组织破坏[28]。随着骨免疫学领域的研究以及补体与骨骼相互作用的研究进展,越来越多的证据显示,补体在生理和病理条件下均可调节骨代谢,补体激活调节和影响多种急/慢性炎症性疾病的发展与进程[29-30]。因此,针对补体对骨生成和破坏的免疫学机制研究,不仅能够加深我们对骨骼疾病的理解,而且为治疗多种骨骼疾病提供了新思路。

3.1 补体治疗骨质疏松症

骨质疏松症是一种严重影响人类健康的慢性退行性骨病,其特征是骨的微结构破坏、骨量减低、骨的脆性增加,从而导致继发性骨折风险增加。随着对骨质疏松症研究的深入,骨质疏松症的相关治疗药物已经从早期的骨矿物质补充药物发展到目前的调节骨偶联的药物。这些药物可以抑制破骨细胞分化,减少骨吸收,改善骨微结构,增强骨密度,降低骨折风险[31]。体内实验研究表明,补体C3在卵巢切除术后参与小鼠骨内稳态调控,缺乏补体C3可减少骨质流失,改善骨小梁微结构及骨骼机械性能[29]。因此,基于卵巢切除术的模型,抗补体C3的治疗可防止绝经后的骨质流失。

3.2 补体在创伤后骨修复中的作用

对于创伤后骨修复,研究表明抑制补体过表达对减少炎症反应、促进骨重塑也起着重要作用。有报道称,在骨折愈合初期成骨细胞表达C5aR1显著上调,如在炎症早期特异性阻断C5aR1则可消除严重创伤对骨折愈合的负面影响[32]。然而,另一项研究表明,成骨细胞特异性C5aR1过度表达的小鼠中,骨折愈合受到干扰,骨含量、骨矿物质密度和弯曲刚度显著降低,这可能是由于破骨细胞数量显著增加所致,表明成骨细胞中的C5aR1信号在骨折后的骨再生中起着负性作用[22]。在对补体过敏毒素C5a的另一受体C5aR2的研究中发现,骨折后,C5aR1基因敲除小鼠炎症反应减弱,全身和肺部炎症减少,中性粒细胞向骨折部位的募集减少;而C5aR2基因敲除小鼠的炎症反应增强。在愈合阶段,C5aR1和C5aR2均可刺激破骨细胞的形成及软骨向骨的转化[12]。这些研究表明受体C5aR1和C5aR2在骨折后的早期免疫反应中具有不同的作用,但二者均可影响破骨细胞分化和软骨细胞的成骨转化,协同参与骨折修复。这对于减少骨折后的炎症反应,促进骨折愈合的治疗提供了新思路。目前,人们已经开始关注破骨细胞功能调节中补体级联反应的C5a/C5aR轴,并将其作为治疗骨病变的潜在治疗靶标,在新合成的C5aR拮抗剂中,DF3016A可以通过抑制C5aR信号转导和转录来抑制破骨细胞降解活性,对于未来临床应用具有重要价值[33]。

3.3 补体治疗代谢性骨关节疾病

此外,在其他代谢性骨关节疾病中,如骨关节炎、类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)、强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)等,有足够的证据表明,补体可通过三种激活途径参与骨关节炎的疾病过程,如骨重塑失调、骨赘形成、滑膜炎、软骨细胞炎症反应、关节退化等[34]。在类风湿关节炎中,疾病的进展取决于关节侵蚀以及骨重塑的平衡。在酵母聚糖诱导的类风湿性关节炎模型鼠的研究中,在体内注射眼镜蛇毒因子(cobra venom factor,CVF)耗尽补体,发现补体缺乏导致滑膜和骨骼中成熟破骨细胞的数量减少,从而限制了骨吸收[35]。在关节炎模型中,抑制补体活性可以降低转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)和TGF-β3的表达,改善晚期滑膜炎症和骨破坏,防止骨赘形成和衰老细胞的产生[36]。

强直性脊柱炎是一种慢性轴性脊柱性关节炎,以椎间盘纤维环及其附近结缔组织纤维化以及关节强直为特点的慢性炎症性自身免疫性疾病,主要累及骶髂关节和脊柱。在AS发病原理的探究中,研究者发现蛋白多糖(proteoglycan,PG)诱导的AS小鼠模型中,补体系统被充分激活,体内骨髓和脾脏中性粒细胞显著增加,骨髓中的巨噬细胞减少,表明骨髓中巨噬细胞向破骨细胞分化。体外实验还表明,补体激活可以增加成骨细胞或破骨细胞中TGF-β1和(或)RANKL的 水平。RANKL调 节破骨细胞分化,TGF-β1可直接刺激破骨前体分化和破骨细胞形成。通过细菌来源的补体抑制剂Efb-C可以抑制补体激活,降低成骨细胞活性,显著延缓了小鼠AS的进展,证实了补体抑制剂在AS治疗中具有巨大潜力[37]。

4 小结与展望

在骨偶联这一由多种细胞因子以及膜分子介导的成骨细胞和破骨细胞精确平衡中,补体及其受体扮演了重要角色。本文综述了补体作为偶联因子参与破骨细胞和成骨细胞之间相互作用的最新研究进展,讨论了补体作为偶联因子在调节骨代谢内平衡稳定、外伤后的骨愈合、炎症环境下骨重塑中发挥重要作用,为骨代谢异常相关疾病的治疗提供新思路。目前关于补体对骨偶联作用的相关机制研究十分有限,多种补体成分对于骨免疫疾病的相互作用关系及病理机制仍处于探索阶段。补体作为固有免疫的重要成分对于骨骼系统生理及病理所发挥的作用具有广阔的研究空间,补体对于临床疾病的治疗应用也需进一步探索。