二氧化钛纳米管抗菌性能在口腔种植领域的研究进展*

王昊阳 孟维艳

随着种植手术成功率的提升及植入技术的改进，越来越多的患者选择种植义齿来替代缺失的牙齿[1]。医用级钛(Ti)及其合金具有良好的生物相容性、耐腐蚀性和低免疫原性等优势，是目前最为常见的口腔植入物材料。但由于纯钛表面具有生物惰性且不具备抗菌活性，细菌可与成骨细胞及其他细胞竞争粘附于钛植入物表面形成初始定植，最终形成成熟的生物膜。这种潜在致病菌的粘附、增殖与种植体周围的炎症变化直接相关，进而严重影响骨整合导致种植义齿修复失败[2,3]。随着纳米医学的兴起，通过纳米改性形成的植入物表面被赋予优异的抗菌能力。作为一种独特的纳米结构，TiO2纳米管可通过阳极氧化等方法制备而成[4]。有文献证实，TiO2纳米管促进成骨细胞的黏附和增殖，并表现出减少表皮葡萄球菌的初始粘附与定植的能力。与光滑钛表面相比，TiO2纳米管在具备抗菌能力的同时增强了成骨活性，从而提升植入物成功率[5]。此外，TiO2纳米管还可作为抗菌剂载体发挥抗菌作用。综上，具备抗菌作用的TiO2纳米管在治疗种植体周围炎方面有巨大潜力。然而，目前尚缺乏TiO2纳米管抗菌机制的具体总结。本综述旨在探索TiO2纳米管表面结构对细菌粘附增殖的影响，总结TiO2纳米管作为抗菌剂载体的研究现状并对TiO2纳米管在口腔种植抗菌领域的应用进行展望。

1.单纯TiO2纳米管的抗菌能力

从细菌粘附到植入物表面至最终成熟形成生物膜的过程通常分为两个阶段。第一阶段中，细菌与植入物表面快速相互作用形成可逆性附着，此时粘附的细菌容易脱落。第二阶段，细菌表面结构与植入物表面发生特异性与非特异性相互作用并产生强烈的附着力，这一阶段是缓慢且不可逆的。随后定植的细菌分泌细胞外基质，最终形成生物膜。一旦形成成熟的生物膜，抗生素的治疗将变得十分困难[6]。单纯TiO2纳米管的抗菌特性主要包括抑制细菌初始粘附以及杀灭细菌两方面。

1.1 单纯TiO2纳米管对细菌粘附的抑制作用目前，关于细菌与纳米结构相互作用的研究已经取得巨大突破，影响细菌粘附定植的因素包括材料的刚度、疏水性、表面粗糙度、表面电荷以及细菌的细胞膜结构、刚度等，但目前调控细菌与纳米结构相互作用的准确机制尚未得知[7]。Valdez-Salas 等[8]证明TiO2纳米管可减少革兰氏阴、阳性菌的初始粘附。同时作者还发现，铜绿假单胞菌(革兰氏阴性菌)相比于表皮葡萄球菌(革兰氏阳性菌)发生更多的形态改变，其原因可能是相比于革兰氏阳性菌，革兰氏阴性菌肽聚糖层较薄，流体双层膜更多，在细菌迁徙运动时更易于与纳米结构锚定从而发生形变。TiO2纳米管的亲水性及粗糙度亦是影响细菌初始粘附的重要因素。目前较公认的说法为材料亲水性与细菌粘附的关系与细菌种类息息相关，实验证明，疏水性的细菌如表皮葡萄球菌及金黄色葡萄球菌更易粘附于疏水性的表面，并且材料表面的疏水性是细菌的粘附的主要驱动力，相反亲水性的细菌易于粘附于亲水性表面[9,10]。但影响植入物表面细菌定植是由细菌与宿主细胞共同决定的，并非细菌单方面因素。根据“表面竞争”理论，宿主细胞及细菌会对植入物表面产生竞争性粘附，若宿主细胞的早期定植并先于细菌充满覆盖植入物表面可以免受细菌的影响，可大大减少植入物术后感染的风险，相反若细菌赢得竞争，植入表面最终会被生物膜覆盖，导致感染[11]。Peng 等[5]建造了亲水性的TiO2纳米管表面，亲水的表面促进了成骨细胞黏着斑的形成进一步加速成骨细胞的早期粘附，随后扩散、增殖分化，同时减少表皮葡萄球菌的附着。此外，亲水性的TiO2纳米管表面还可促进纤连蛋白的粘附，随后通过与细胞表面受体相互作用加速了成骨细胞的定植，改善早期成骨的能力[12,13]。虽然关于细菌与宿主细胞的“表面竞争”理论尚不成熟且缺乏细菌与细胞间相互作用的长期观察，而且材料表面亲水性并非影响细菌粘附的唯一因素。但通过建造亲水性材料表面加速成骨细胞的早期定植同时抑制细菌的定植以减少细菌感染导致的种植失败具有重要的临床指导意义。另一方面，目前关于TiO2纳米管表面粗糙度对细菌粘附性影响的说法尚未统一，因为伴随着粗糙度的变化会导致材料表面亲水性及空间形貌发生改变。但大多数研究表明细表面粗糙度越大的TiO2纳米管亲水性越好，越不利于细菌的粘附[5,14]。

1.2 单纯TiO2纳米管的杀菌作用 在之前的研究中，Ercan 等[15]证明TiO2纳米管的管径形态可以引起细菌应激反应导致其细胞膜的破坏从而产生杀菌作用。并且研究结果显示随着TiO2纳米管直径的增加，抗菌效果得到增强，其中直径为80nm的TiO2纳米管抗菌效果最佳。Peng 等[5]也得出了类似的结论，相比于直径较小(30nm)的TiO2纳米管大尺寸(80nm)的TiO2纳米管可更有效的限制表皮葡萄球菌的增殖。然而，关于纳米管尺寸参数对其抗菌性能的讨论尚未达成一致。Narendrakumar等[16]得到了不同的结论，作者提出直径为15nm 的TiO2纳米管对血链球菌和变形链球菌的抗菌效果更优异。Kummer 等[17]的研究表明，小尺寸纳米管(20nm)相比于大直径纳米管(80nm)表现出更好的抗菌效果。造成这些差异化的结果可能原因是阳极氧化法的制备条件难以保证一致，电压、电解质溶液等参数的变化及TiO2纳米管的晶型不同均会对TiO2纳米管的形态及抗菌特性产生影响[18]。

TiO2纳米管的抗菌机制比较复杂，纳米管的尺寸、表面粗糙度、表面湿润性等均为影响其抗菌效果的重要因素。尽管关于这些因素对TiO2纳米管抗菌性能影响的说法尚未统一，但TiO2纳米管已经展现出其优异的抗菌效果，且纳米管的制备方法简单且较为可控，是一种有前景的抗感染植入物材料。

2.TiO2纳米管的光催化杀菌作用

TiO2是一种有前途的光催化剂，在紫外光的催化作用下可产生活性氧类物质(ROS)，在氧化应激作用下破坏细菌的细胞膜以达到抗菌效果[19]。随着纳米医学的发展，TiO2纳米管的晶型、尺寸、形貌在加工过程中均可控，使其在光催化消毒领域展现出良好的应用前景。实验证明，在紫外光照射24h下，TiO2纳米管抗大肠杆菌及金黄色葡萄球菌活性高达97.53%和99.94%[20]。Liu 等[21]通过水热合成法将TiO2纳米颗粒均匀涂覆在TiO2纳米管内，相比于单纯TiO2纳米管，复合物光催化位点更多，在紫外光照射下产生大量ROS。高浓度的ROS 破坏细胞膜，从而杀灭表皮葡萄球菌与牙龈卟啉单胞菌并抑制了生物膜形成。由于紫外照射可能会对实验者产生伤害，目前研究者们致力于在可见光条件下改善TiO2纳米管的抗菌性能。Moon 等[22]通过离子溅射法将Au 与Pt 纳米粒子沉积在TiO2纳米管纳米管表面，在波长600nm 的可见光催化作用下具有杀灭金黄色葡萄球菌的作用，并且具有良好的生物相容性，提高了骨髓间充质细胞成骨相关基因的表达。

3.TiO2纳米管作为抗菌剂载体

TiO2纳米管由于具有开口的顶端以及封闭的底部的独特结构，已被广泛用作递送抗菌剂的载体平台。而且，作为一种局部递送药物载体，可大大降低全身给药的成本及产生耐药性的风险。但目前物理吸附法及冻干法等药物装载方式难以达到理想的药物释放效果。为改善药物突释带来的不利影响，研究者们通过改变纳米管的尺寸[23]、使用聚合物多层膜对纳米管表面进行包封[24]等方法，延缓抗菌剂的释放，获得长期抗感染的效果。目前，较为常见的掺入TiO2纳米管的抗菌剂如下。

3.1 抗生素 抗生素类药物如万古霉素、米诺环素、头孢菌素等作为抗菌剂的研究长达数十年。Riahi 等[23]延长阳极氧化时间增加了TiO2纳米管长度，随后再通过电泳沉积法将大量的万古霉素沉在TiO2纳米管底部，其载药量为物理吸附法的6 倍，并且使第一小时内的药物突释量从84%降至23%，显著延长了万古霉素的释放时间。Fathi 等[25]通过阳极氧化法制造了直径约为110nm，长度为40nm TiO2纳米管以最大程度负载万古霉素，随后通过静电纺丝技术将纳米丝素蛋白纤维涂覆在TiO2纳米管表面，使金黄色葡萄球菌的粘附减少，且万古霉素释放时间延长至30 天。作为临床上使用最多的抗感染药物，抗生素的作用机理在这里不做过多阐述，而且其导致的细菌多药耐药性问题仍难以解决，应致力于寻找新型非抗生素类抗菌剂。

3.2 金属纳米粒子 金属纳米粒子包括直径小于100nm 的金属及金属氧化物纳米颗粒，许多金属自身便具备一定的抗菌能力，当他们的尺寸达到纳米级别时，他们的抗菌特性会得到增强[26]。作为目前研究最多的抗菌剂，银纳米粒子的抗菌机理包括破坏细菌的细胞膜的完整性，使细胞内容物泄露而杀死细菌。此外，银纳米粒子还可促进氧化应激反应，从而产生过量的活性氧，干扰细菌DNA 的合成[27]。但同样Ag 纳米粒子可以通过胞吞、胞吐作用在真核细胞中被累计，诱导氧化应激并对真核细胞的DNA 复制产生影响。但可能由于相比于真核细胞细菌的结构相对简单，核膜的缺乏使环状DNA双链直接暴露于胞质内的银纳米颗粒中，导致细菌对氧化应激反应更敏感[28]。但是，高浓度银离子的细胞毒性问题仍不可忽视。为获得银离子持续稳定释放且减轻细胞毒性的效果，Guan 等[29]将银纳米粒子通过聚多巴胺涂覆在TiO2纳米管表面，与纯钛对照组相比，银纳米粒子抑制了金黄色葡萄球菌与大肠杆菌的生长。同时聚多巴胺使银释放更加平缓，降低银纳米粒子的细胞毒性作用。Yuan 等[24]在TiO2纳米管底物上覆盖了自组装壳聚糖/ 海藻酸二醛多层膜并将银纳米颗粒封装在纳米管阵列中，结果显示多层膜抑制了细菌的粘附并延缓了银离子的释放。除预期的抗菌效果以外，多层膜展示出对成骨细胞的亲和力，促进了成骨细胞的粘附增殖。

从临床安全性角度考虑，银并非是人体内所含的必要元素。因此，更应选择利于排泄且人体营养所需的元素，例如：锌。纳米氧化锌的抗菌机理与纳米银的抗菌机理类似，包括：破坏细菌的细胞膜、金属离子释放、产生活性氧及空间效应等[30]。Liu 等[31]通过水热法制备了不同锌离子浓度的含锌TiO2纳米管，其抗菌效果均优于单纯的TiO2纳米管，其中0.015M 浓度的锌离子可以最好的杀灭牙龈卟啉单胞菌并下调变形链球菌粘附相关基因及毒力基因gtfB、gtfC、gtfD 的表达，并且未对干细胞生物相容性产生影响。已有相关实验将ZnO 纳米颗粒与其他种类金属纳米颗粒共同掺入TiO2纳米管中，例如ZnO/ Sr 等，可以表现出兼具成骨抗菌的双功能效果[32]。虽然目前存在制备过程较为繁琐且不同种金属纳米颗粒在纳米管内分布不均的问题，但这为以后制造多功能钛植入物提供新思路。

3.3 抗菌肽 抗菌肽是一系列具有抗菌活性及免疫调节能力的短肽序列的总称，具有广谱的抗菌活性、低毒性及低耐药性等优点。Li 等[33]使用赖氨酸残基替换人腮腺分泌蛋白的部分氨基酸序列合成了新型抗菌肽GL13K，随后通过浸泡法将其存储在TiO2纳米管内。合成的阳离子抗菌肽GL13K可与牙龈卟啉单胞菌带负电荷的细胞膜相互作用破坏其屏障功能进而影响细菌活性，而未经修饰的TiO2纳米管抗牙龈卟啉单胞菌效果较差。但由于物理吸附法的限制，抗菌肽在前30 分钟内存在突释行为。Zhang 等[34]对TiO2纳米管基体进行了改造，通过控制阳极氧化过程的电压形成了孔径不同的双层纳米管。底部为大孔径(140nm)的药物储存层，上部为小孔径(35nm 或70nm)“纳米帽”以控制药物的释放。双层钛纳米管可控制抗菌肽ponericin G1长期释放高达60 天。除抗菌肽对细菌的杀伤作用以外，顶部小孔径的“纳米帽”还可抵抗细菌的初始粘附，这对长期抗感染有重要意义。作为替代抗生素的新型抗菌剂，抗菌肽的杀菌作用已被广泛研究，但随着抗菌肽的大量使用，多种抗菌肽靶向作用单一蛋白为基因突变及细菌产生耐药性提供了可能。细菌可通过胞外多糖避免抗菌肽与细菌细胞膜的直接接触，还可以分泌蛋白酶降解抗菌肽以及与宿主防御肽的交叉抗性等方法对抗菌肽产生耐药性[35]。故应进一步探究细菌对抗菌肽的耐药的具体机制以便合成新型抗菌肽。

4.总结

目前针对TiO2纳米管的抗菌特性已经做了大量研究。虽然这种具备高比表面积、排列紧密的纳米管状结构已展示出良好的抗菌作用，且联合抗菌剂的应用已显示令人信服的抗感染作用。然而，关于TiO2纳米管研究仍然需要更深入的研究以探索TiO2纳米管最佳抗菌尺寸，以寻求兼具生物相容性及优异抗菌能力的表面形貌。且作为抗菌剂载体，药物难以控制突释行为以及细菌耐药性仍亟待解决。未来可通过合理掺杂不同种类抗菌剂协同增强TiO2纳米管的抗菌效果同时降低细菌耐药性的风险。TiO2纳米管的光动力治疗将会是一个很好的研究领域，在安全的可见光催化下，通过与金属纳米颗粒的结合可获得长期有效的抗菌效果，并降低了患者的经济负担。目前关于可见光催化TiO2纳米管活性的研究尚浅，未来应进行更多的动物实验进行体内研究。