红藤中sargentol对PC12细胞的神经保护作用和分子对接研究

汤 建，孙惠芳，张腾腾，安凤霞，耿春叶，闻崇炜*

1亳州学院中药学院，亳州 236800；2江苏大学药学院，镇江 212013

神经元的损伤及死亡涉及的环节广泛，主要有氧化应激、神经炎症、兴奋性神经毒性、钙离子(Ca2+)超载、线粒体损伤、凋亡蛋白、自噬等[1,2]。神经保护是神经系统疾病防治的关键环节，姜黄素、白藜芦醇、人参皂苷等天然产物通过调节ROS、抗炎、抑制兴奋性神经毒性等机制发挥了良好的神经保护作用，在抗缺血性脑损伤、提高学习认知能力等方面有着良好的应用前景[2,3]。

红藤(Sargentodoxacuneata(Oliv.) Rehd.et Wils.)是我国特有的一种植物，具有解毒消痈，活血止痛，祛风除湿等功效[4]。红藤中的化学成分主要有酚酸类、苯丙素、木脂素等，其提取物具有抗炎、抗氧化、神经保护等药理活性[5]。本实验室在前期研究中从野生红藤中分离到苯丙醇苷类化合物sargentol(6 kg的植物藤茎中分离得到190 mg)，但关于该化合物药理活性的报道较少[6]。本文拟评价sargentol对PC12细胞损伤模型的保护作用，并基于分子对接技术对可能的作用机制进行讨论，以期为发现中药来源的神经保护活性成分提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

Sargentol(见图1)由本实验室自制，纯度≥95%；1640完全培养基和新生牛血清购于维森特生物技术(南京)有限公司；ROS检测试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司；PC12低分化细胞由江苏大学药学院高静教授实验室提供；其他化学试剂均为分析纯；AutoDock Tools 1.5.6和AutoDock Vina(美国The Scripps Research Institute)；PyMOL(TM) 1.7.4.5 Edu(美国Schrodinger，LLC公司)和Discovery Studio 2016 client(美国BIOVIA公司)。

图1 Sargentol化学结构Fig.1 The chemical structure of sargentol

1.2 Sargentol对PC12细胞增殖的影响

生长期PC12细胞用1640培养基悬浮，接种至96孔板，每孔2×105个，37 ℃，5% CO2培养箱中培养24 h。吸去上清，加入sargentol(培养基溶解，含0.2% DMSO，终浓度均为0.1、1、10 μmol/L)，继续孵育24 h。加20 μL的MTT(5 mg/mL)再孵育3 h。吸去上清，每孔加入100 μL的DMSO溶解，得紫色溶液，采用酶标仪(570 nm)检测吸光度(A)，计算细胞存活率，每组设立3个复孔。

1.3 MTT法测定损伤PC12细胞的存活率

生长期PC12细胞接种至96孔板，细胞密度6×103个/孔，37 ℃，5% CO2细胞培养箱中培养24 h。吸去上清，加入sargentol溶液，终浓度均为0.1、1、10 μmol/L，继续孵育5 h。加入不同的化学试剂(正常组只加培养基)，继续孵育24 h。加20 μL的MTT(5 mg/mL)再孵育3 h。吸去上清，每孔加入100 μL的DMSO溶解产生的固体至紫色溶液，酶标仪570 nm处检测吸光度(A)，计算细胞存活率，每组设立3个复孔。所加的化学试剂分别是H2O2(0.5 mmol/L)、鱼藤酮(rotenone，10 μmol/L)、NaN3(50 μmol/L)。

1.4 DCFH-DA探针检测细胞内ROS水平

参照文献[7]，PC12细胞接种至24孔板中，4×104个/孔，37 ℃，5% CO2条件下培养12 h。Sargentol(0.1、1、10 μmol/L)预处理5 h后再加入H2O2(0.5 mmol/L)损伤1 h。PBS洗涤2次，每孔加入终浓度为10 μmol/L含DCFH-DA的无血清培养基20 μL。培养箱中黑暗条件下孵育20 min，PBS洗涤细胞3次，荧光酶标仪激发波长488 nm，发射波长525 nm测定DCF荧光强度。计数细胞后根据细胞数及各实验组荧光OD值计算每组细胞的DCF荧光强度/104细胞。

1.5 靶标蛋白结构的获取和预处理

通过检索文献[1-3,7-9]，选定14个蛋白(见表1)为对接受体，并从PDB数据库(http://www.rcsb.org)下载其PDB文件。将蛋白结构导入AutoDock Tools 1.5.6中，删除原配体，水分子，加氢，保存为pdbqt格式，以备分子对接。

表1 神经保护相关蛋白靶点

1.6 Sargentol与受体的分子对接

Sargentol化学结构经能量最小化处理后，保存为pdbqt格式，用AutoDock Vina与14种选定的靶点蛋白(受体)进行半柔性对接，根据对接打分值来确定潜在的作用靶点。原配体与受体重新对接，其结合能打分值为阈值。通常认为均方根偏差(RMSD)在2 Å范围内。

2 结果

2.1 Sargentol对PC12细胞增殖的影响

如图2所示，sargentol在0.1和1 μmol/L浓度时明显促进PC12细胞增殖，细胞存活率与正常组(Ctrl，以100%计)分别增加21.6%和11.5%。而采用较高浓度(10 μmol/L)sargentol干预PC12细胞时，其细胞存活率反而较正常组低4.7%。但三个浓度下细胞存活率都高于95%，所以后续的研究中均选用0.1、1、10 μmol/L三个浓度。

图2 Sargentol对PC12细胞存活率的影响Fig.2 Effect of sargentol on PC12

2.2 Sargentol对H2O2致PC12细胞损伤的保护作用

如图3所示，H2O2(0.5 mmol/L，模型组)对PC12细胞具有显著的损伤作用，与正常组相比，PC12细胞存活率下降至42.5%(P< 0.01)。Sargentol(0.1、1、10 μmol/L)预处理后，PC12细胞存活率分别增加至正常组的73.8%、76.7%和57.9%(Ctrl组以100%计)。10 μmol/L的sargentol组的存活率反而低于1 μmol/L组，这与“2.1”项下数据一致，可能是较高浓度的sargentol反而对PC12细胞增殖具有一定的抑制作用。

图3 Sargentol对H2O2损伤PC12细胞存活率的影响Fig.3 Effect of sargentol on the survival rate of PC12 cells injured by = 3)注：与正常组比较，##P < 0.01；与模型组比较，*P < 0.05，**P < 0.01。Note: Compared with Ctrl,##P < 0.01;Compared with model group,*P < 0.05,**P < 0.01.

2.3 Sargentol对鱼藤酮致PC12细胞损伤的保护作用

如图4所示，10 μmol/L的鱼藤酮对PC12细胞有显著损伤，与正常组比较，细胞存活率下降至48.4%(P< 0.01)。而sargentol(0.1、1、10 μmol/L)预处理后，PC12细胞存活率分别增加至正常组的51.9%、65.2%和72.9%。

图4 Sargentol对鱼藤酮损伤PC12细胞存活率的影响Fig.4 Effect of sargentol on the survival rate of PC12 cells injured by = 3)注：与正常组比较，##P < 0.01。Note: Compared with Ctrl,##P < 0.01.

2.4 Sargentol对NaN3致PC12细胞损伤的保护作用

如图5所示，50 μmol/L的NaN3对PC12细胞有显著损伤，与正常组比较，细胞存活率下降至44.9%(P< 0.01)。而sargentol(0.1、1、10 μmol/L)预处理后，PC12细胞存活率分别增加至正常组的61.2%、69.1%和73.6%。

图5 Sargentol对NaN3损伤PC12细胞存活率的影响Fig.5 Effect of sargentol on the survival rate of PC12 cells injured by = 3)注：与正常组比较，#P < 0.05。Note: Compared with Ctrl,#P < 0.05.

2.5 Sargentol对H2O2损伤PC12细胞内ROS水平的影响

氧化应激(ROS)效应是细胞损伤或凋亡常见的原因[7-9]，本实验中以H2O2致PC12细胞损伤模型为例，采用DCFH-DA染料法检测sargentol对细胞内ROS水平的影响。如图6所示，PC12细胞与H2O2共同孵育1 h后，细胞内ROS水平(以1×104个细胞的DCF荧光密度值计)显著增加至正常组的3.5倍(P< 0.01)。与H2O2组相比，0.1、1、10 μmol/L浓度的sargentol分别降低ROS水平6.5%、10.7%、27.2%。Sargentol能剂量依赖性地降低细胞内ROS水平。Sargentol对ROS效应的抑制是保护H2O2致PC12细胞损伤的重要机制之一。

图6 Sargentol对H2O2损伤PC12细胞内ROS水平的影响Fig.6 Effect of sargentol on ROS level in PC12 cells injured by H2O2 = 3)注：与正常组比较，##P < 0.01；与模型组比较，**P < 0.01。Note: Compared with Ctrl,##P < 0.01;Compared with model group,**P < 0.01.

2.6 分子对接结果

本研究将原配体、sargentol分别与14个蛋白进行对接，均选择第一行(即dist from rmsd l.b.值和best mode rmsd u.b.值均为0)的打分值。具体结果见表2。

表2 Sargentol与14种蛋白受体的结合能

根据结合能和比值R(见表2)可知，排名前五的受体分别是TLR2(5D3I)、iNOS(2Y37)、PI3K(1E7V)、Keap1(4L7B)和IKKβ(3RZF)，这也是sargentol潜在的作用靶点。虽然Caspase-1(1RWN)与化合物的结合能仅有-5.9 kcal/mol，但与其阈值相同，后续的研究中也值得关注。Sargentol与5D3I、2Y37的结合能力最强，其打分值均为-7.7 kcal/mol。3D图显示sargentol的分子刚好卡在蛋白5D3I和2Y37的凹槽内(见图7A和7B)。图7C显示，sargentol与VAL348等10余种氨基酸残基之间存在范德华力；其苯环与LEU160形成Pi-Alkyl键，与PHE322、PHE349形成Pi-Pi键；糖的3-OH的O与LYS347形成氢键，但糖4-OH的H与ILE319以及6-OH的O与LEU317之间存在斥力。图7D显示，sargentol与SER236等10种氨基酸残基之间存在范德华力；三元环的O与ASN364、醇羟基的H与TYR483、糖3-OH的H与TRP366之间形成氢键；苯环与TRP188形成Pi-Pi键，与CYS194形成Pi-Donor氢键；但糖3-OH的H与MET368之间存在斥力。化合物sargentol与周围的氨基酸残基结合紧密，存在着作用明显的作用力，有助于与靶点蛋白的结合。

图7 Sargentol与5D3I(A、C)和2Y37(B、D)的分子对接图Fig.7 Docking of sargentol with proteins 5D3I (A,C) and 2Y37 (B,D)

3 讨论与结论

鱼藤酮损伤PC12细胞常用于建立帕金森病的细胞模型，而NaN3损伤PC12细胞模型常用于抗阿尔茨海默病化合物的初步筛选[9,10]。本文中sargentol对鱼藤酮和NaN3引起的PC12细胞损伤无明显抑制(P> 0.05)，而对H2O2损伤模型最为敏感，对H2O2引起的PC12细胞内ROS亦有显著抑制作用。

为了进一步研究sargentol的神经保护作用机制，本文中采用AutoDock Vina软件虚拟筛选其结合靶点蛋白。考虑到H2O2损伤的细胞模型中，ROS效应是细胞损伤或凋亡常见的原因[9]，因此，我们选定了ROS效应以及炎症相关蛋白为主的14种蛋白进行分子对接。

根据结合能和比值R确定了sargentol潜在的作用靶点TLR2(5D3I)、iNOS(2Y37)、PI3K(1E7V)、Keap1(4L7B)和IKKβ(3RZF)。其中Keap1-Nrf2-ARE信号通路是细胞防御ROS损伤的最重要机制之一[8]，Keap1(4L7B)与sargentol的结合能为-7.2 kcal/mol，提示sargentol对蛋白Keap1可能存在较强的激活能力，具有潜在的基于Keap1-Nrf2-ARE信号通路的抗ROS作用，这一推测与实验“2.2”项下数据一致。TLR2(5D3I)、iNOS(2Y37)和PI3K(1E7V)是ROS和炎症的重要调节蛋白[11,12]，本次分子对接中与sargentol的结合能分别是-7.7、-7.7和-7.3 kcal/mol，特别是前者，结合强度超过原配体的结合能(-7.5 kcal/mol)。提示sargentol可能是通过抑制氧化应激—炎症—氧化应激循环发挥神经保护作用。前期研究中发现sargentol能显著抑制小鼠耳肿胀[6]，其抗炎活性与本次分子对接预测一致。根据结合能，sargentol在抑制兴奋性神经毒性、凋亡基因调节方面的能力较弱，以后的研究中将会关注sargentol的抗炎方面的活性与机制研究。