基于纳米孔测序技术的柑橘黄龙病检测方法建立

卢慧林,陈大嵩,陈逢浩,叶静文,欧阳革成*

(1. 广东省科学院动物研究所，广东省动物保护与资源利用重点实验室，广东省野生动物保护与利用公共实验室，广州 510260；2. 华南农业大学植物保护学院，广州 510642)

柑橘黄龙病(Huanglongbing)是最具毁灭性的柑橘病害(Hall and McCollum, 2011; Wang, 2019)，在全球的分布超过50多个国家和地区(Bové, 2006; 黄爱军, 2014; European Food Safety Authority (EFSA),etal., 2019)，是全球柑橘产业健康发展的瓶颈。由于目前无法选育出抗病树种，除了防治其媒介昆虫-柑橘木虱以外，及时移除病树，避免感染扩散，是防控黄龙病的关键措施之一，其中最重要的就是要及时快速地对柑橘黄龙病进行早期检测和诊断(郑正, 2017)。近年来，分子生物学检测、高光谱检测等技术，越来越普遍地用于柑橘黄龙病的识别与监测(许美容等, 2015)，但仍然达不到生产要求。多聚酶链反应(Polymerase chain reaction, PCR)是目前应用于柑橘黄龙病识别的一种较为可靠且普遍的技术，但该方法存在的问题是难以实现实时在线检测(陆健强等, 2021)。高光谱检测可实现实时实地快速识别，但只对有明显症状的染病树有用，难以做到早期诊断。

随着高通量测序方法的快速发展，测序成本的不断降低，高通量测序被广泛应用于各种病原的测序或检测中(陈大嵩等, 2021)。牛津纳米孔技术公司(Oxford Nanopore Technologies, ONT)的掌上纳米孔测序仪MinION是一款新研发的便携式测序仪，它能够直接进行DNA和RNA测序，拥有超长的读长、实时测序、随时终止等特性，被广泛应用于多种病原体的检测(Wongsurawatetal., 2019; Warwicketal., 2019; 陈大嵩等, 2021)。本文尝试利用MinION测序仪对感染黄龙病的柑橘DNA样品进行测序，对比不同软件的比对结果，优化分析手段，从而实现利用高通量测序技术对黄龙病菌进行有效监控和高效测定。

1 材料与方法

1.1 DNA提取

4个柑橘叶片(砂糖桔Citrustrticulata，典型黄龙病斑驳叶片)标本均取自广东省科学院动物研究所环境昆虫研究中心养虫室，叶片总DNA提取方法：采用Biospin植物基因组试剂盒，实验步骤参照说明书进行调整：称取0.1 g植物叶片叶脉，用灭菌剪刀剪碎，置于2.0 mL离心管中，加入100 μL LP Buffer，并放入研磨珠，将离心管放入研磨机内研磨，研磨后在加入350 μL LP Buffer，并混合均匀；于65℃下温浴15 min，每5 min颠倒混匀；加入150 μL DA缓冲液，混合均匀，放置冰浴中5 min；将管中混合物全部转移至Shredder spin colum，于14 000 xg离心3 min；将上述滤液转移到一个灭菌后的1.5 mL离心管；加750 μL或上述滤液体积1.5倍的P Binding缓冲液，并混合均匀；将上述混合液体转移至Spin colum，然后6 000 xg离心60 s，并弃去接液管中液体；加入500 μL G Binding缓冲液至Spin colum，于10 000 xg离心30 s，并弃去接液管中液体；加入600 μL Wash缓冲液，于10 000 xg离心30 s，并弃去接液管中液体；空管离心Spin colum，10 000 xg离心1 min，并将Spin colum转移至一个新灭菌的1.5 mL离心管；加入100～200 μL Elution缓冲液，室温温育1 min；12 000 xg离心1 min，并弃去Spin colum，1.5 mL离心管中液体含有DNA。

1.2 黄龙病病原菌检测

参照许美容等(2016)检测方法，用基于柑橘黄龙病菌16S rDNA基因的OI1/OI2c (5′-GCGCGTATCCAA-TACGAGCGGCA-3′/5′-GCCTCGC GACTTCGCAAC-CCAT-3′)引物扩增目的DNA样品，以健康柑橘材料提取的DNA分别作为阴性对照，以感染黄龙病的柑橘DNA为阳性对照。PCR扩增反应完成后，取6 μL PCR产物和6×Loading Buffer相混合，于室温下进行1%琼脂糖凝胶电泳，电压为120 V，时间为30 min，在凝胶成像系统下观察结果，如在1 167 bp处出现条带，则为阳性样品。

1.3 纳米孔测序文库构建

参考纳米孔测序连接测序试剂盒说明书进行纳米孔测序文库构建。首先，利用微量分光光度计测量溶液中DNA含量，并保证1 μg以上的DNA用于下一步实验；其次利用试剂盒NEBNext End repair / dA-tailing Module (NEB：E7546)对打断的DNA进行末端修复；第三步，利用磁珠AMPure XP beads(Agencourt)对DNA文库进行回收；第四步，利用末端连接试剂盒NEB Blunt / TA Ligase Master Mix (NEBZ: M0367)与连接测序试剂盒1 D Genomic DNA by ligation (Oxford Nanopore Technologies: SQK-LSK108)进行DNA末端测序接头的连接，完成DNA测序文库的构建；最后，参照试剂盒说明书的方法进行对测序芯片进行质检(陈大嵩等, 2021)。

1.3 纳米孔测序与分析

测序获得的fastq文件利用长序列比对软件GraphMap、minimap2、bwa在mem模式下参数-x选择ont2d以及bwa在mem模式下参数-A选择2、参数-B选择3比对到柑橘黄龙病亚洲种基因组序列(GenBank: NZ_CP010804.1)。测序获得的fastq文件转换成fasta文件后，利用blastn比对到柑橘黄龙病亚洲种基因组序列(GenBank: NZ_CP010804.1)。比较不同比对软件与比对方案之间的差异。

2 结果与分析

2.1 病原菌检测结果

采集的4个样品中，经常规PCR检测显示，样品编号4的柑橘DNA扩增到1条大小约1 167bp的条带，确定为黄龙病菌(图1)，以此DNA样品进行下一步的测序和分析。

图1 柑橘样品中黄龙病菌的PCR扩增电泳图Fig.1 PCR amplification electrophoretogram of Candidatus Liberibacter asiaticus in citrus samples注：M，DL2000 DNA marker；+，阳性对照(感染黄龙病的柑橘DNA样品)；-，阴性对照(健康柑橘DNA样品)；1～4，采自广东省科学院动物研究所实验室的柑橘样品。Note: M, DL2000 DNA marker; +, Positive control (DNA sample of citrus infected CLas); -, Negative control (DNA sample of citrus un-infected CLas); 1～4, Citrus samples taken from the laboratory of Guangdong Key Laboratory of Animal Conservation and Resource Utilization.

2.2 纳米孔测序与分析

利用MinION测序仪对确诊黄龙病菌感染的柑橘叶片总DNA进行测序，获得约25 M条序列共3.75 G个碱基(图2)。序列最长27 147 bp，序列长度的中位数为1 239 bp，平均长1 492 bp。利用Blast、GraphMap、minimap2以及两种bwa的比对方法将测序结果比对到黄龙病基因组上，其中Blast、GraphMap、minimap2、bwa AB与bwa x分别比对上5 702、42 557、6 200、7 269与56 712条序列(图3)，其中Blast、minimap2与bwa AB分析方法获得的结果比较接近。将比对算法的软件GraphMap、minimap2以及bwa得到的结果利用比对到黄龙病菌基因组的位置展示成圈图(图4)，可见比对结果均匀地比对到黄龙病菌基因组上，并未发现严重的偏倚现象。

图2 MinION测序原始序列长度堆积图Fig.2 Histogram of the raw sequences by MinION sequencer注：横坐标，序列长度；纵坐标，序列长度的频数，即每个序列长度区间内有多少个序列。Note: X-axis, Sequence length; Y-axis, Sequence frequency, namely the sum of the sequences within each sequence length interval.

图3 比对结果的韦恩图Fig.3 Venn diagram of comparison results注：bwa_x，bwa在mem模式下参数-x选择ont2d；bwa_AB，bwa在mem模式下参数-A选择2、参数-B选择3。Note: bwa_x, bwa mem mapping mode with -x ont2d; bwa_AB, bwa mem mapping mode with -A 2 -B 3.

图4 分析软件比对到基因组的位置Fig.4 The location of the genome mapped by each software注：外环，黄龙病菌基因组长度的示意图；中环，各软件比对到黄龙病菌基因组位堆积图，高度表示比对到该基因组位置的碱基数量；内环，黄龙病菌基因组的GC含量。Note: Outer, Diagram of genome length of Huanglongbing; Central, Histogram of each software mapping to Huanglongbing genomic, and the height indicates the sum of bases mapped to the genomie; Inner, GC content of Huanglongbing genome.

3 结论与讨论

纳米孔测序技术Nanopore sequencing为近几年兴起的第三代测序技术，由牛津纳米孔技术公司(Oxford Nanopore Technologies, ONT)开发，与以往的测序方法不同，该技术基于电信号的测序技术，通过电流信号的特征性改变，来确定正在通过该孔的DNA或RNA的碱基序列，进行实时单分子测序(Senol Calietal., 2019; 陈大嵩等, 2021; 张皓博等, 2021)。该技术能够边解链边测序，无需PCR扩增和化学样品标记，极大简化了测序试验流程，有效降低了假阳性，而且不需要模板设计引物，甚至可以鉴定新病原等的特性，可以与PCR鉴定方法形成互补(Fengetal., 2015; 陈大嵩等, 2021)，该技术具有高通量、实时、长片段读长、易集成、时效性强、体积较小便于携带等优势，可应用于动植物和微生物基因组测序、宏基因组测序、RNA直接测序、微生物检测、DNA与RNA甲基化检测、mRNA的polyA长度定量等研究(Senol Calietal., 2019; 曹影等, 2020; 陈大嵩等, 2021)。杜宇等(2021)利用纳米孔技术构建和注释了蜜蜂球囊菌的首个高质量全长转录组，为探究球囊菌转录组的复杂性、完善参考基因组的序列和功能注释信息以及深入开展球囊菌可变剪接体的功能研究提供了关键依据。在人类疾病检测中，纳米孔测序也显示出明显的优势，该技术有着先前基因测序技术没有的优势，其能够提供动态、实时的测序，可在数小时或更短的时间内获取和分析DNA或RNA序列，且文库制备简单，不受环境限制，便于携带，使现场基因测序成为可能，从而进一步加快了检测时间，有助于迅速诊断疾病并及时进行针对性治疗(Euskirchenetal., 2017; 张皓博等, 2021)。

柑橘黄龙病的实时实地早期检测和快速诊断技术是防控黄龙病的关键措施之一，目前尚无满足生产实际要求的技术和产品。本文利用纳米孔测序技术对携带黄龙病菌叶片样品的DNA进行测序，并利用Blast、GraphMap、minimap2以及两种bwa的比对方法将测序结果比对到黄龙病基因组上，比对结果均匀的比对到黄龙病菌基因组上，并未发现严重的偏倚现象，验证了其测序结果的可靠性。随着技术发展和产品成本的降低，可以为柑橘黄龙病的检测诊断提供一种新的技术方案。由于本技术能够一次性地对同一样品中混和存在的不同物种基因信息进行灵敏准确的检测识别，在未来的病虫智能监控系统中整合这一技术，对收集(如灯光诱集、机械吸取或扫网采集等)到的害虫样本进行自动化检测，以弥补因柑橘木虱虫体过小或损坏难以进行光学识别的不足，并可同时检测虫体是否携带有黄龙病菌，对有黄龙病发生风险但尚未有黄龙病实际发生的柑橘种植区提供实时实地的监控与预警,同样也可用于对其它危险性入侵害虫的监控。