温针灸治疗轻中度膝骨关节炎疗效观察及其对TLR4/NF-κB信号通路的影响

孙桂芳,张雪锋,茅瑜,葛艳

（上海市闵行区马桥社区卫生服务中心,上海 201111）

膝骨关节炎（knee osteoarthritis, KOA）是一种以关节软骨退行性改变为主要病理特征的骨关节疾病,以持续性膝关节疼痛为主要临床表现,是引起中老年慢性关节疼痛、致残的高危因素。随着人口老龄化的发展,发病率显著上升[1]。目前,KOA的发病机制尚不明确,炎性改变是该病发生发展的重要病理基础。研究显示,Toll 样受体 4（toll-like receptors 4, TLR4）/核因子κB（nuclear factor kappa-B, NF-κB）信号通路在关节软骨及滑膜的破坏过程中呈激活状态,该信号通路可引起下游白介素（interleukin, IL）-1β、IL-6、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factors, TNF）-α等炎性因子的转录表达,使关节炎症反应和结构破坏持续进展[2]。KOA的治疗方法主要包括口服非甾体类抗炎药或软骨保护类药物,以及关节腔注射抗炎药物,这些治疗仅暂时缓解临床症状,且有明显不良反应,故临床应用受限。温针灸具有温经通络、行气活血、散寒除湿、消肿止痛的功效,是膝骨关节炎常用的中医外治法之一。温针灸治疗可显著减轻KOA患者的疼痛症状,改善患者的生存质量,然而其作用机制尚不明确[3-5]。本研究旨在观察温针灸治疗 KOA的临床疗效及其对TLR4/NF-κB信号通路的影响,探究其可能的作用机制。

1 临床资料

1.1 一般资料

纳入的KOA患者均为2019年7月至2020年7月在上海市闵行区马桥社区卫生服务中心中医科门诊的就诊患者,按照随机数字表法分为对照组和观察组。共纳入患者95例,治疗过程中脱落4例,对照组45例和观察组 46例最终纳入统计。对照组中男 15例,女 30例;年龄 42～76岁,平均（57±8）岁;病程2～10年,平均（5.25±1.48）年。观察组中男14例,女 32例;年龄 44～78岁,平均（60±9）岁;病程1～11年,平均（5.79±1.53）年。两组患者性别、年龄、病程比较,差异无统计学意义（P＞0.05）,具有可比性。

1.2 诊断标准

参照中华医学会骨科学分会《骨关节炎诊疗指南（2018年版）》[6]中KOA的相关诊断标准。

1.3 纳入标准

①符合上述诊断标准;②年龄 50～80岁;③符合骨关节炎 Kellgren-Lawence（K-L）分级标准中Ⅰ～Ⅲ级;④自愿参加并签署知情同意书。

1.4 排除标准

①有患肢血管及神经损伤史或明显膝关节内、外翻畸形者;②并发骨肿瘤或骨结核者;③关节间隙明显狭窄或骨性强直者;④合并其他系统疾病者;⑤对艾条或洛芬类药物有过敏史者;⑥近 1个月内接受过其他方法治疗者;⑦处于妊娠期或哺乳期者。

1.5 剔除标准

①试验过程中出现严重并发症者;②数据缺失严重,无法评估疗效者。

2 治疗方法

2.1 对照组

局部皮肤清洁后,将氟比洛芬凝胶贴膏（北京泰德制药股份有限公司,国药准字 J20160090）对准膝盖部位贴敷,每日1次,每次1贴,连续4周。

2.2 观察组

在对照组治疗基础上予温针灸治疗。取患侧犊鼻、内膝眼、血海、梁丘、足三里、阳陵泉、阴陵泉。患者取仰卧位,穴位局部皮肤常规消毒后,用一次性毫针（0.30 mm×40 mm）刺入穴位0.5～1.0寸,行平补平泻法,得气后,留针。将长1.5 cm清艾条插入针柄上,点燃艾条下端,留针20 min（留针期间可更换一次艾条）。隔日治疗1次,连续4周。

3 治疗效果

3.1 观察指标

3.1.1 膝关节功能评定

采用膝骨关节炎自评量表（Western Ontario and McMaster University osteoarthritis index,WOMAC）[7]进行评定。包括关节疼痛、晨僵、日常活动难度3个方面,共24个参数。关节疼痛共20分、晨僵共8分、日常活动难度共68分;总分最低0分,最高96分,分值越高关节功能越差。

3.1.2 疼痛、健康和生活质量评估

采用疼痛模拟量表（visual analogue scale,VAS）[8]、健康评价调查表（health assessment questionnaire, HAQ）[9]、生活质量评价简表（MOS item short from health survey, SF-36）[10]综合评估患者疼痛程度、健康状况和生活质量。VAS评分,即用1根两端分别为“0”（无痛）和“10”（极重度疼痛）的标尺表示疼痛,在标尺相应位置标注疼痛程度,分值越高疼痛越严重。HAQ评分即对患者过去1周穿衣、梳头、上下床等 20个方面基本日常生活能力以及情绪进行评估,满分72分,分值越高表示生活质量越低。SF-36评分即从生理机能、躯体疼痛、一般健康状况等8个维度评估,满分100分,分值越高表示生活质量越好。

3.1.3 关节液中IL-1β、IL-6和TNF-α水平的检测

治疗前后分别抽取患者关节液 2～3 mL,离心15 min（速度 3 000 r/min）,取上清,﹣80 ℃保存并待用。采用酶联免疫吸附法检测两组患者治疗前后关节液中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平。试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供,采用双抗体夹心法进行检测。

3.1.4 关节液中 TLR4、髓样分化初级反应基因（myeloid differenation primary response gene 88,MyD88）和NF-κB mRNA表达的检测

采用TRIzol试剂盒（Invitrogen公司）提取RNA。采用反转录酶试剂盒（BD公司）反转录合成 cDNA第 1链,用 RT-PCR检测两组患者关节液中 TLR4、MyD88、NF-κB mRNA的相对表达。引物均由上海生工生物工程有限公司合成,以 GAPDH作为内参照。取 PCR产物各 5 µL,以 GAPDH 作为内参基因,采用 2﹣△△CT的数据分析方法分析目的基因的相对表达,得出 TLR4 mRNA/GAPDH、MyD88 mRNA/GAPDH 及 NF-κB（P65）mRNA/GAPDH的比值。

3.1.5 不良反应发生情况

记录治疗过程中两组患者不良反应的发生情况。

3.2 疗效标准

采用尼莫地平法[11]计算疗效指数。疗效指数＝[（治疗前WOMAC总分－治疗后WOMAC总分）/治疗前WOMAC总分]×100%。

痊愈:疗效指数≥80%。

显效:疗效指数≥50%且＜80%。

有效:疗效指数≥25%且＜50%。

无效:疗效指数＜25%。

3.3 统计学方法

所有数据均采用 SPSS18.0统计学软件进行统计分析。符合正态分布的计量资料用均数±标准差表示,比较采用t检验。计数资料比较采用卡方检验。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

3.4 治疗结果

3.4.1 两组治疗前后WOMAC各项评分和总分比较

治疗前,两组WOMAC各项评分和总分比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。治疗后,两组WOMAC各项评分和总分均较同组治疗前降低（P＜0.05）,且观察组均低于对照组（P＜0.05）。详见表1。

表1 两组治疗前后WOMAC各项评分和总分比较 （±s，分）

表1 两组治疗前后WOMAC各项评分和总分比较 （±s，分）

注:与同组治疗前比较 1）P＜0.05;与对照组比较 2）P＜0.05

项目 观察组（46例） 对照组（45例）治疗前 治疗后 治疗前 治疗后疼痛 14.52±1.84 7.13±2.211）2） 14.62±1.77 9.04±2.351）僵硬 6.17±1.08 3.41±0.911）2） 5.91±1.36 4.04±1.141）日常活动难度 52.93±3.60 36.34±9.141）2） 53.98±3.14 40.42±8.171）总分 73.63±4.70 46.89±10.601）2） 74.51±4.28 53.51±8.521）

3.4.2 两组治疗前后VAS、HAQ和SF-36评分比较

治疗前,两组VAS、HAQ和SF-36评分比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。治疗后,两组VAS和HAQ评分均较同组治疗前降低（P＜0.05）,且观察组均低于对照组（P＜0.05）。治疗后,两组SF-36评分均较同组治疗前升高（P＜0.05）,且观察组高于对照组（P＜0.01）。详见表2。

表2 两组治疗前后VAS、HAQ、SF-36评分比较 （±s，分）

表2 两组治疗前后VAS、HAQ、SF-36评分比较 （±s，分）

注:与同组治疗前比较 1）P＜0.05;与对照组比较 2）P＜0.05,3）P＜0.01

项目 观察组（46例） 对照组（45例）治疗前 治疗后 治疗前 治疗后VAS 5.76±0.82 2.98±0.771）2） 5.80±0.84 3.93±0.991）HAQ 42.26±4.48 25.58±4.411）2） 43.17±3.86 25.57±4.401）SF-36 247.22±33.11 476.00±45.971）3） 236.15±30.66 407.37±29.281）

3.4.3 两组临床疗效比较

对照组总有效率为 60.0%,观察组总有效率为87.0%,两组比较差异具有统计学意义（P＜0.05）,详见表3。

表3 两组临床疗效比较 （例）

3.4.4 两组治疗前后关节液中IL-1β、IL-6和TNF-α水平比较

治疗前,两组关节液中IL-1β、IL-6和TNF-α水平比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。治疗后,两组关节液中IL-1β、IL-6和TNF-α水平均较同组治疗前降低（P＜0.05）,且观察组均低于对照组（P＜0.05）。详见表4。

表4 两组治疗前后关节液中lL-1β、lL-6和TNF-α水平比较 （±s，ng/L）

表4 两组治疗前后关节液中lL-1β、lL-6和TNF-α水平比较 （±s，ng/L）

注:与同组治疗前比较 1）P＜0.05;与对照组比较 2）P＜0.05

项目 观察组（46例） 对照组（45例）治疗前 治疗后 治疗前 治疗后IL-1β 14.54±1.75 9.46±1.971）2） 14.63±1.79 11.65±1.571）IL-6 6.17±1.08 3.61±0.911）2） 5.91±1.36 4.17±1.141）TNF-α 52.93±3.60 39.74±4.201）2） 53.98±3.14 46.34±3.211）

3.4.5 两组治疗前后关节液中 TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表达比较

治疗前,两组关节液中TLR4、MyD88、NF-κB mRNA相对表达量比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。治疗后,两组关节液中 TLR4、MyD88、NF-κB mRNA相对表达量均较同组治疗前降低（P＜0.05）,且观察组均低于对照组（P＜0.05）。详见表5。

表5 两组治疗前后关节液中TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表达比较 （±s）

表5 两组治疗前后关节液中TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表达比较 （±s）

注:与同组治疗前比较 1）P＜0.05;与对照组比较 2）P＜0.05

项目 观察组（46例） 对照组（45例）治疗前 治疗后 治疗前 治疗后TLR4/GAPDH 3.41±1.08 1.76±0.651）2） 3.48±0.76 2.87±0.361）MyD88/GAPDH 6.18±1.07 3.65±0.821）2） 5.92±1.36 4.79±0.841）NF-κB/GAPDH 4.38±1.63 3.01±0.771）2） 4.28±1.27 3.60±0.991）

3.5 不良反应

对照组有 6例患者出现膝关节局部皮肤过敏,不良反应发生率为13.3%;观察组仅有1例患者出现晕针现象,休息后即恢复如常,不良发应发生率为2.2%。两组组间比较,观察组低于对照组,差异具有统计学意义（χ2＝3.989,P＝0.046＜0.05）。

4 讨论

膝骨关节炎（KOA）是中老年人最常见的膝骨关节疾病,早、中期时常以轻度或中度非持续性疼痛为主,且与活动呈明显相关性,随着疾病进展可出现明显的内翻、外翻和（或）旋转畸形,严重影响患者生活质量[12]。KOA发病率高达8.1%～18.0%,致残率高,病程长,给患者家庭和社会造成巨大的经济负担[13-14]。目前临床治疗药物繁多,治疗方式多样,但存在药物疗效不肯定、用药不规律或不良反应明显的问题,给临床治疗增加了一定难度和困惑[15]。

本病在中医学中属“痹证”范畴。中医学理论认为,痹证多以肝肾亏损为本,外感风寒湿邪为标,风寒湿邪聚于关节而致经脉不通,发为痹证,病程日久不愈,终致血瘀脉络,经络闭阻,不通则痛。针灸可促进局部血液循环,改善血液流变学和血流动力学,减轻疼痛,以Ia级证据级别、A级推荐针灸作为慢性膝关节疼痛无法手术者的替代疗法[16]。艾灸不论是在缓解膝关节疼痛,还是改善症状评分或是改善关节功能方面,均优于口服西药,与关节腔注射治疗和局部用药疗效相当甚至优于它们,并且不良反应少[17]。温针疗法是将针刺与艾灸相结合,刺激特定穴位,具有温通经脉、消瘀止痛的作用,适用于寒湿闭阻、经络壅滞之证[18]。研究表明温针疗法具有提高骨代谢指标,抑制IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性因子表达,改善关节功能的作用[19-20]。本研究结果表明,温针结合氟比洛芬凝胶贴膏可显著改善患者的疼痛、僵硬、关节活动度的评分,而且可显著改善患者的健康状况和生活质量,临床疗效优于单用氟比洛芬凝胶贴膏。

TLR4/NF-κB信号通路是机体重要的炎症通路,其参与的炎症反应在 KOA的发生发展中具有重要作用,影响着KOA进展的各个阶段。研究显示,骨关节炎症时关节软骨中的TLR4呈高表达状态[21],NF-κB是一种广泛存在的核转录因子,能调控细胞外基质的沉积和重建而致关节软骨肥厚、关节腔隙变窄[22]。TLR4/NF-κB信号通路激活后,关节中的炎性细胞因子如 IL-1β、IL-6、TNF-α等高表达,抑制Ⅱ型骨胶原和蛋白聚糖的合成,促进多种炎性因子、基质金属蛋白酶以及前列腺素的分泌,在软骨基质降解和骨吸收过程中起着关键作用[23]。本研究显示,温针联合氟比洛芬凝胶贴膏可下调KOA患者关节液中IL-1β、IL-6、TNF-α的水平,并抑制 TLR4、MyD88、NF-κB（P65）mRNA 转录水平,其作用机制可能是通过调控 TLR4信号转导,抑制下游MyD88和NF-κB（P65）表达,阻断炎性细胞因子分泌,从而改善关节疼痛相关症状。

综上,本研究结果表明在药物贴膏治疗基础上采用温针灸治疗膝骨关节炎有助于缓解临床症状,改善患者生活质量,且安全性较好,其机制可能与抑制TLR4/NF-κB信号通路介导的炎性反应有关。