“秩边透水道”针法对子宫内膜异位症大鼠Beclin-1、LC3调节作用的研究

刘璇,王海军,张黎,刘高峰,曹玉霞,司佳弘,李帅帅,孙瑞英

（1.山西中医药大学,太原 030619;2.天津中医药大学,天津 301617;3.山西中医学院第三中医院,太原 030024;4.台州市第一人民医院,台州 318082）

子宫内膜异位症（endometriosis, EMS）指正常脱落的子宫内膜上皮细胞因携带活性,而种植在腹壁、卵巢等位置[1],育龄妇女易患,主要临床表现为下腹痛、不孕、性交痛。该病发病率逐年上升,达10%～20%[2],不孕妇女中发病率更高,严重危害了患者的正常生活和日常工作,但目前西医主要通过激素和外科手术治疗,机体副作用大且患者复发率高[3]。

针灸作为一种安全、有效、快速的纯绿色疗法,被越来越多的患者认可,吸引了社会关注。山西中医药大学冀来喜教授制定了“秩边透水道”针法的临床操作规范,系统、客观地评价了此针法临床使用的安全性和有效性,并总结了此针法的适应证、禁忌证,由最初的治疗前列腺相关疾病拓展至泌尿系统和生殖系统[4]的各类疾病,诸如原发性痛经[5]、外阴瘙痒等妇科及产后尿潴溜[6]等产科疾患,通过解除局部肌肉痉挛来缓解痛经,而且该针法取穴少而精,临床使用价值高。

有研究证实EMS的发生发展中存在自噬的介入[7],而临床实践中发现针刺治疗 EMS有着较好的疗效,但其作用机制有待进一步研究。为进一步探明其治疗EMS的作用机理,本研究拟采用EMS大鼠模型,透射电镜观察超微自噬结构,并通过检测大鼠子宫内膜组织中LC3、Beclin-1基因和蛋白表达水平,以探明“秩边透水道”针法治疗EMS的作用机理。现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

SPF级雌性SD大鼠,50只,8周龄性成熟未交配,体质量（180±20） g,购于北京维通利华实验动物技术有限公司,动物许可证编号为 SCXK（京）2016-0006,在山西中医药大学科研大楼针灸推拿实验室动物房饲养,房间湿度40%～50%,温度（24～26） ℃。本实验已得到山西中医药大学伦理委员会的批准。根据随机数表法,大鼠被分为模型组、假手术组、针刺组、激动剂组和针刺加抑制剂组,每组10只。

1.2 主要仪器和试剂

一次性针灸针 0.25 mm×15 mm,雷帕霉素（美国MCE, HY-10219）,3-甲基腺嘌呤（美国 MCE,HY-19312）,苯甲酸雌二醇,青霉素粉针剂（华北制药股份有限公司,规格 0.96 g,160万单位）,高级荧光显微镜 Eclipse Ci-L（日本 Nikon）;全景切片扫描仪 PANNORAMIC DESK/MIDI/250/1000（3DHISTECH, Hungary）,透射电镜HITACHI HT 7700 120 kv;LeicaRM 2135自动切片机（德国 Leica）;荧光定量PCR仪Stepone plus（ABI）;酶标检测仪Rt 2100 c（Rayto）;ACTIN抗体（Servicebio, GB12001）;Beclin 1 抗体（Servicebio,GB13228-2）;LC3 抗体,（武汉三鹰,14600-1-ap）。

1.3 大鼠EMS模型的建立

造模方法参考文献[8],术前 1 d对大鼠禁食,不禁饮,选用苯甲酸雌二醇（0.1 mg/kg）,给50只SD大鼠皮下注射,人为干预使大鼠在同一动情周期进行手术,腹腔注射10%水合氯醛,按0.3 mL/100 g的剂量麻醉。固定大鼠四肢,备皮,棉球蘸 75%的乙醇,对施术部位消毒,在尿道口上方1.5 cm处,沿腹中白线,依次剪开腹壁肌层、腹膜肌层（切口控制在2 cm以内）,找到左侧子宫,在上下两端结扎,剪取长2 cm子宫,清洗子宫体,纵向切开子宫腔,剥去子宫肌层后,将内膜剪成大概5 mm×5 mm,缝于大鼠右侧腹部。造模结束后,腹部注射青霉素钠液[9]。腹部切口用丝线缝合。密切关注各组大鼠术后的精神状态以及手术切口的愈合情况,醒后照常喂养。假手术组大鼠不造模。在建模 15 d后,开腹探查造模是否成功。

1.4 干预方法

针刺组将大鼠的四肢固定于自制鼠板上,根据《实验针灸学》[10]并参照大鼠骨骼与体型取两侧“秩边”穴（臀外下部,股骨大转子与荐椎尾椎结合部连线外1/3与中 1/3交点处[11]）,穴位处消毒,选 0.25 mm×15 mm的不锈钢毫针针刺,从秩边穴进针,顺着同侧的水道穴逐渐深入,进针深度 13 mm左右,针下落空后,普通提插捻转,不行补泻,手法轻微,留针20 min;激动剂组予以大鼠自噬激动剂雷帕霉素（50 µmoL/L）,2 mg/（kg·d）,腹腔注射;针刺加抑制剂组大鼠在针刺治疗的基础上予以自噬抑制剂 3-MA（3-甲基腺嘌呤400 nmoL/µL）,1.5 mg/（kg·d）,腹腔注射。模型组及假手术组只进行固定。各组 1周干预 6次,共干预 3周。

1.5 指标检测

1.5.1 异位病灶观察及测量

造模15 d后开腹,肉眼观察异位种植膜生长情况,卡尺测量其长（A）、宽（B）、高（C）,根据椭球体积公式V（mm3）＝0.52×A×B×C 计算体积,以 V＞25 mm3为建模成功。

1.5.2 子宫内膜组织病理学观察

取大鼠子宫内膜组织固定切片,脱蜡,染色后光镜观察其病理变化。根据文献中病理诊断标准[12],造模成功的标准为子宫内膜上皮细胞可在种植膜囊壁内层结构中发现,呈整齐柱状排列,局部还有丰富的新鲜微血管形成。

1.5.3 大鼠超微结构电镜观察

确定大鼠子宫内膜新鲜组织的取材部位,体积不超过1 mm×1 mm×1 mm,置于电镜固定液中,磷酸缓冲液漂洗后锇酸磷酸缓冲液室温固定,磷酸缓冲液再次漂洗后组织依次脱水;渗透过夜;烤箱聚合;超薄切片机切片60～80 nm;铀铅双染色;电镜下观察切片,采集图像,进行分析。

1.5.4 RT-qPCR法检测大鼠Beclin 1 mRNA、LC3 mRNA表达

从﹣80 ℃冰箱中取出大鼠子宫内膜组织。采用Trizol法提取RNA,Nanodrop 2000酶标仪测定RNA的纯度及质量浓度,进行逆转录,按照试剂盒操作步骤,利用 RocheqPCR仪检测,该基因相对表达量的计算方法是2﹣△△Ct法（p）。引物由武汉塞维尔生物科技有限公司提供合成,片段长度为 138 bp,退火温度 60 ℃,用qPCR法检测提取大鼠子宫在位、异位内膜的总 RNA,用RT-qPCR法检测LC3、Beclin-1。引物序列见表1。

表1 实时荧光定量PCR引物序列

1.5.5 Western blot法检测大鼠Beclin 1、LC3蛋白表达

从﹣80 ℃冰箱中取出大鼠子宫内膜组织。检测时取出内膜组织加入RIPA裂解缓冲液,研磨均匀,静置,取上层清液,离心 10 min,提取内膜组织总蛋白溶液,测定蛋白浓度,充分变性蛋白,电泳,转膜,漂洗,温封闭处理,加入抗体,一抗稀释比均为1:1 000,孵育。洗膜后,加入二抗,二抗稀释比为 1:3 000,室温孵育,洗模,采集凝胶图像,采用Alpha软件分析目标带的光密度值,目的蛋白与内参灰度值比值即为各目的蛋白的相对表达量。

1.6 统计学方法

采用SPSS25.0软件对数据进行分析。若为正态分布的计量资料,用均数±标准差表示,符合正态分布的数据组间比较采用单因素方差分析,进一步采用LSD法进行两两比较。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EMS大鼠异位病灶体积变化

与治疗前比较,模型组治疗后异位病灶体积增大但差异无统计学意义（P＞0.05）,其余各组大鼠的异位病灶体积均不同程度缩小（P＜0.01）;与模型组比较,针刺组、激动剂组、针刺加抑制剂组大鼠治疗后的异位病灶体积均明显缩小（P＜0.01）,囊性生长物变扁平,囊内清亮液体也有所减少;与针刺加抑制剂组比较,针刺组病灶体积明显降低（P＜0.05）,详见表2。

表2 各组EMS大鼠异位病灶体积的改变 （±s，mm3）

表2 各组EMS大鼠异位病灶体积的改变 （±s，mm3）

注:与同组治疗前比较 1）P＜0.01;与模型组比较 2）P＜0.01;与针刺组比较 3）P＜0.05

组别 n 剂量/mg（kg·d） 治疗前 治疗后假手术组 10 - - -模型组 10 - 90.22±19.15 117.33±38.68针刺组 10 - 91.35±18.97 31.77±15.251）2）激动剂组 10 2 91.66±20.11 33.16±10.621）2）针刺加抑制剂组 10 1.5 90.68±19.92 72.58±18.201）2）3）

2.2 EMS大鼠子宫内膜病理学变化

造模15 d后,开腹观察大鼠异位灶种植情况,发现移植在腹壁的子宫内膜生长非常良好,种植物呈囊状,体积已超出原种植范围,有丰富的新鲜毛细血管流通,囊泡内有清亮液体。假手术组的大鼠子宫内膜上皮细胞呈高柱状,排列紧凑,结构完整,未见明显异常;模型组大鼠子宫内膜中有囊肿,血供丰富,肌纤维排列顺序不规则;针刺组的大鼠子宫内膜上皮有萎缩、脱落的矮立方状细胞,周围毛细血管较少,出现纤维化。激动剂组的大鼠子宫内膜上皮细胞较完整,少量坏死,血供减少。针刺加抑制剂组的大鼠子宫内膜上皮细胞大量坏死,肌纤维排列不规则,详见图2。

图2 各组大鼠内膜组织病理学的变化（HE染色，×100）

2.3 各组大鼠子宫内膜自噬小体及其超微结构分析

假手术组大鼠子宫内膜细胞中线粒体丰富,存在一定数量的自噬小体,核膜完整、胞核规则、核内染色质分布均匀,双层结构清晰;模型组大鼠子宫内膜细胞内自噬泡极少,核膜短缺,核不规则,染色质不均匀,双层结构不清晰,上皮细胞呈重度水肿,线粒体数量少;针刺组大鼠子宫内膜细胞含有较多自噬小体,有丰富的细胞器,完整的核膜;激动剂组大鼠子宫内膜细胞中自噬泡较多,核膜较完整,粗面内质网数量较多;针刺加抑制剂组大鼠子宫内膜细胞中有少量自噬泡,胞质内有不少细胞器发生变形、萎缩,核膜欠缺,核不规则。详见图3。

图3 各组大鼠子宫内膜细胞的自噬体超微结构

2.4 各组大鼠子宫在位、异位内膜中 LC3、Beclin-1 mRNA表达水平的观察

与假手术组比较,模型组在位、异位内膜的LC3、Beclin-1 mRNA表达水平显著降低（P＜0.05）;与模型组比较,各干预组异位内膜的LC3 mRNA表达水平均显著升高（P＜0.05）;针刺组与激动剂组大鼠异位内膜的LC3、Beclin-1 mRNA 表达无统计学差异（P＞0.05）;针刺组、激动剂组大鼠异位内膜的LC3、Beclin-1 mRNA表达均明显高于针刺加抑制剂组（P＜0.05）。表明EMS大鼠在位、异位内膜中LC3及Beclin-1 mRNA表达水平下降,“秩边透水道”针法、雷帕霉素激动剂均可提高EMS模型大鼠异位内膜中LC3及Beclin-1的表达水平,详见表3。

表3 各组大鼠LC3、Beclin-1mRNA表达水平比较 （±s）

表3 各组大鼠LC3、Beclin-1mRNA表达水平比较 （±s）

注:与假手术组比较 1）P＜0.05;与模型组比较 2）P＜0.05;与针刺组比较 3）P＜0.05;与激动剂组比较 4）P＜0.05

组别 n LC3 Beclin-1在位内膜 异位内膜 在位内膜 异位内膜假手术组 10 16.81±3.72 - 14.03±2.12 -模型组 10 5.33±0.881） 2.34±0.621） 4.12±1.041） 2.13±0.711）针刺组 10 12.09±2.172） 10.33±2.012） 11.58±3.412） 9.25±2.012）激动剂组 10 10.13±2.192） 8.66±1.822） 10.06±2.932） 7.87±1.592）针刺加抑制剂组 10 7.17±2.462）3）4） 5.69±1.742）3）4） 6.44±1.532）3）4） 3.98±1.132）3）4）

2.5 各组大鼠子宫在位、异位内膜中LC3、Beclin-1蛋白表达水平的观察

与假手术组比较,模型组在位、异位内膜 LC 3、Beclin-1蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）;与模型组比较,各干预组异位内膜 LC3蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05）;针刺组与激动剂组大鼠 LC3、Beclin-1蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）;针刺组、激动剂组大鼠LC3、Beclin-1蛋白表达均明显高于针刺加抑制剂组（均P＜0.05）。表明EMS大鼠异位内膜中LC3及Beclin-1蛋白表达水平下降,“秩边透水道”针法、雷帕霉素激动剂均可提高EMS模型大鼠异位内膜中LC3及Beclin-1的表达水平,详见表4、图4。

图4 各组大鼠Beclin1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达条带图

表4 各组大鼠Beclin-1、LC 3的灰度值分析 （±s）

表4 各组大鼠Beclin-1、LC 3的灰度值分析 （±s）

注:与假手术组比较 1）P＜0.05;与模型组比较 2）P＜0.05;与针刺组比较 3）P＜0.05;与激动剂组比较 4）P＜0.05

组别 n LC-3Ⅰ LC-3Ⅱ Beclin-1在位内膜 异位内膜 在位内膜 异位内膜 在位内膜 异位内膜假手术组 10 3.54±0.23 - 3.54±0.17 - 3.46±0.19 -模型组 10 1.21±0.111） 0.13±0.041） 0.59±0.411） 0.17±0.021） 0.99±0.021） 0.13±0.051）针刺组 10 2.78±0.172） 0.35±0.082） 3.10±0.372） 0.37±0.032） 2.78±0.242） 0.35±0.122）激动剂组 10 2.02±0.112） 0.32±0.102） 2.55±0.322） 0.28±0.122） 2.16±0.072） 0.33±0.012）针刺加抑制剂组 10 1.24±0.122）3）4） 0.16±0.022）3）4） 1.88±0.042）3）4） 0.18±0.112）3）4） 1.49±0.052）3）4） 0.19±0.012）3）4）

3 讨论

子宫内膜异位症（EMS）是近现代出现的病名,但因其痛经、不孕等临床表现及病程进展,当将此病归属于中医学“癥瘕”“不孕”范畴[13]。导致EMS最重要的原因就是瘀血的产生,瘀血内停,气机受阻,不通则痛,即为痛经;积血瘀滞日久,由小到大,逐渐形成有形之物,故见癥瘕;瘀血内停,阻滞胞宫胞脉,使得两精不得相合成孕,故发为不孕。目前,EMS发病机制研究不明,存在多种学说[14],其中“种植学说”是目前广泛受到认可的理论[15],认为异常脱落的子宫内膜组织具有一定的活性,可随经血逆流,进入其他组织,种植在腹膜、膀胱、卵巢等位置,浸润生长,而形成此病。另外妇产科手术及相关诊查操作,也可导致子宫内膜细胞异位种植。

近年来EMS与细胞自噬之间的潜在关联越来越得到科研人员的重视。在对自噬机制不断深入的研究中发现,自噬在子宫内膜异位症的疾病发生、病程发展中扮演着不可或缺的重要角色,因此深度挖掘剖析自噬相关基因,或许能成为临床治疗 EMS的一个新的创新点。有研究表明在机体应对刺激时,自噬可为细胞提供能量,维持内环境稳定[16],避免了细胞的凋亡、坏死;另一方面,自噬又可为异位内膜细胞提供帮助,以适应新的异位病灶环境,提供细胞存活所必须的能量,在异位组织开始新的种植、浸润生长,而此功能的过度兴奋又会促进细胞凋亡、坏死,加重 EMS,因此适度地激活子宫内膜细胞自噬是治疗EMS的关键[17]。

各组大鼠子宫内膜的超微结构显示,假手术组大鼠子宫内膜可见完整、光滑的核膜,线粒体等细胞器数量很多,自噬小体和溶酶体分布较多;模型组大鼠子宫内膜内可见变形、破裂的细胞器,自噬小体分布少,提示自噬途径存在异常;针刺组及激动剂组大鼠子宫内膜中均可以观察到较多的自噬小体,提示针刺与自噬激动剂雷帕霉素同样具有诱导自噬的作用;针刺加抑制剂组大鼠子宫内膜仅可观察到少量的自噬小体,说明针刺增强自噬的作用被自噬抑制剂3-MA所抑制,提示针刺发挥作用的机制可能与激活自噬途径相关。

自噬一般发生在真核细胞当中,细胞通过溶酶体,用吞噬的方式清除并降解自身受损的细胞器,是细胞在面对各种压力时的自我保护机制,通过包裹和降解受损的细胞器和生物分子,分解更多的蛋白质,为在恶劣条件下存活的细胞提供所需的氨基酸、游离性脂肪酸等能量物质,同时清除受损、衰老的细胞结构,从而调节细胞的稳态平衡[18]。自噬过程与多种自噬基因有关,其中,自噬过程中最重要的正向调控因子是Beclin-1[19],与 Atg8是同源基因,定位于染色体17q21[20],它可直接调控自噬活性。研究发现[5]Beclin-l mRNA和蛋白在正常妇女中子宫内膜细胞中的表达明显不同于EMS患者子宫内膜细胞中的表达,EMS患者的蛋白和基因表达则明显更低。还有研究表明,Beclinl-1参与了自噬小体双层膜的形成,对自噬的激活具有关键的调控作用,其上调可诱导自噬的发生[21]。自噬相关基因LC3是一种可溶性蛋白质,其表达高低可反映自噬活性的水平,是观察自噬是否发生的一个特异性标志性蛋白[22]。有研究发现子宫内膜周期不同,则LC3表达水平不同,分泌期早、中、晚三期的LC3表达明显高于早增殖期,而晚增殖期的LC3蛋白表达明显高于早增殖期,这表明在不同的子宫内膜周期,子宫内膜细胞表达不同的自噬水平[23]。Choi J等[24]发现,在正常子宫内膜中,分泌期 LC3Ⅱ的水平高于增生期LC3Ⅱ水平,但EMS异位内膜中,LC3Ⅱ没有观察到周期性变化,而且自噬和mTOR活性在整个月经周期中也是恒定的,且 EMS异位内膜表达没有在位内膜高,EMS临床分期越高,表达越低。Zhan L等[25]发现EMS患者若处在子宫内膜分泌期,则他们的在位及异位子宫内膜中Beclin1和LC3水平明显低于健康女士,且异位子宫内膜的这两个因子水平低于在位内膜。但Allavena G等[26]发现,和正常健康女性的在位子宫内膜相比,EMS患者异位内膜的LC3Ⅱ、Beclin1的表达水平明显升高,提示EMS患者的异位病灶中自噬增加。通过上述文献分析,预测可能因不同的临床分期,得出的数据不同,Allavena G等[26]的研究中取得的内膜组织多为增生期,而Zhan L等[25]的研究中取得的内膜组织多为分泌期。本实验在造模前通过注射苯甲酸雌二醇,是为了在造模时尽可能排除大鼠因自身动情周期不同而对造模产生影响,但在最后取材时,并未明确大鼠处于动情期还是动情间期,是本实验的不足之处,希望在后续实验中考虑到这一因素,并做出改善。

在镇痛[27]、改善局部血液循环、调节机体内分泌及免疫机能方面,针刺扮演着重要角色。秩边透水道针法经过了长期的临床探索积累,形成了较成熟且完整的针法系统,其治疗关键在于活血化瘀通络,此针法通过刺激盆丛内脏神经纤维[3],改善子宫及卵巢供血,调节血液流变学状态,治疗 EMS。通过实验发现,模型组大鼠子宫内膜组织中Beclin-1、LC3基因和蛋白表达水平明显低于假手术组,这说明Beclin-1、LC3可能参与了 EMS疾病发生过程,可能是由于低水平自噬使细胞逃脱免疫系统的追捕,从而内膜细胞进行黏附、侵袭、血管形成,导致EMS发生。而EMS大鼠行针刺治疗后,EMS模型大鼠的子宫内膜异位病灶缩小,Beclin-1、LC3的基因和蛋白表达水平明显增加,这说明“秩边透水道”针法可能是以Beclin-1、LC3等因子为治疗靶点,通过激活大鼠子宫异位内膜中Beclin-1、LC3的表达,改变EMS大鼠子宫异位内膜的生物化学特性,进而增加大鼠子宫异位内膜细胞的自噬,促进异位病灶的萎缩,从而达到改善EMS子宫内膜组织的目的。本研究还发现针刺组与激动剂组效果相近,自噬基因及蛋白的表达趋势一样,但在针刺干预的基础上增加抑制剂3-MA后,Beclin-1、LC3表达则明显降低,可能是因为“秩边透水道”针法激活自噬相关基因的作用被自噬抑制剂所抵消,这表明了“秩边透水道”针法有类似雷帕霉素激活自噬的作用。本实验仅观察了EMS大鼠Beclin-1、LC3基因和蛋白表达的变化,尚需进一步研究其上游通路的调控机制。深入研究“秩边透水道”针法对EMS相关自噬因子的调控机制,对临床治疗EMS及降低复发率有显著的作用。