昆虫病原线虫对烟苗的保护效果

谷星慧，崔永和，阮维斌，曹 莉，薛 丹，李江舟*，

屠娅玲1，杭德发1，韩日畴3*

(1. 云南省烟草公司玉溪市公司，烟草行业病虫害生物防治工程研究中心，云南玉溪 653100；2. 南开大学，天津 300071；3. 广东省科学院动物研究所，广东省动物保护与资源利用重点实验室，广东省野生动物保护与利用公共实验室, 广州510260)

小地老虎Agrotisypsilon属鳞翅目Lepidoptera夜蛾科Noctuidae，是危害烟草的重要害虫(蒲小明等, 2016; 伍绍龙等, 2017)。此害虫活动范围大，食性广泛，除水稻等水生植物外，几乎对所有植物的幼苗均能取食(李建一等, 2019)。小地老虎幼虫可将移栽期靠近地面的烟草幼嫩茎部咬断，使幼苗整株死亡，但对大烟株的危害不大，是烟草栽培中非常重要的一种苗期害虫(李根等, 2017)。目前，烟草苗期小地老虎幼虫防治，主要为化学防治(Zhangetal., 2018)，但农药残留严重影响卷烟的品质和安全性(何发林等, 2018)。为保护烟田环境和烟草产品质量，以强调自然因子的控制作用为主的多种生物防控手段越来越受到重视，并应用于烟草苗期小地老虎的防控(李建一等, 2019)。

昆虫病原线虫(主要包括斯氏属Steinernema和异小杆属Heterorhabditis)，作为新型生物杀虫制剂已广泛用于防治农林、牧草、花卉和卫生等害虫(Grewaletal., 2005; Peters, 2013; Labaudeetal., 2018)。这类杀虫制剂具有广泛寄主范围；对寄主具主动搜寻能力，对土栖性害虫特效；可规模化培养，使用方便；对人畜、环境安全(Ehlers, 2001)。分布于工业化国家的生物农药生产公司致力于这类生物农药的研制和商业化，如德国的BASF公司(www.basf.com)和E-nema公司(www.e-nema.de)，瑞典Andermatt Biocontrol (www.biocontrol.ch)，荷兰Koppert公司(www.koppert.nl)等(Ehlers, 2001)。昆虫病原线虫业已应用于防治蔬菜(Chenetal., 1989; Shapiroetal., 1999; Yangetal., 2000; Ebssaetal., 2012; Yanetal., 2014; 武海斌等, 2015)和盆栽或烟田小区烟苗(杨建全等, 2000; 李根等, 2017)的小地老虎幼虫。但存在与种类、测定方法有关的效果不稳定现象(Ebssaetal., 2012; Yanetal., 2014)，因此，有必要利用昆虫病原线虫以及小地老虎幼虫诱食剂保护烟苗免受这一昆虫幼虫危害。

本研究在烟苗移栽时，添加诱食剂距8 cm环绕烟苗，同时施用生物制剂，测定昆虫病原线虫S.carpocapsaeAll 品系对小地老虎幼虫的控制作用，研究其对刚移栽烟苗的保护作用，同时，比较绿僵菌和化学农药对小地老虎的控制作用，为利用昆虫病原线虫防控烟田小地老虎幼虫提供方法。

1 材料与方法

1.1 试验地简介

本实验实施于云南省烟草公司玉溪市公司华宁烟草种植场。烤烟品种为MSK326，每667 m21 100株，株行距120 cm×50 cm。经调查，供试试验田中未发现小地老虎成虫及幼虫，本研究采用人工添加小地老虎幼虫于移栽烟苗周围以实施实验。

1.2 供试昆虫及材料

供试昆虫：本研究使用的小地老虎4龄幼虫于实验室25℃下以人工饲料(购自河南省济源白云实业有限公司)饲养而得(幼虫购自沧州育康农业科技有限公司)；小地老虎食物为每 667 m2将 0.15 kg白糖用1 L温水溶化后倒入0.05 kg白酒、0.05 kg醋、配制成混合液，喷洒到切碎的白菜Brassicapekinensis(Lour.) Rupr.和麦麸(10 kg白菜加1 kg麸皮)上均匀搅拌，堆闷1 h，每株烟苗10 g。

昆虫病原线虫粉剂：昆虫病原线虫S.carpocapsaeAll粉剂采用人工培养基固体培养(韩日畴, 1995)，以蛭石粉贮存于4℃冰箱中(购自潍坊宏润农业科技有限公司)，实验前检查线虫的存活率均高于98%，每株烟苗施用2×105条感染期线虫。

虫尸剂：S.feltiaeSN感染末龄大蜡螟Galleriamellonella幼虫的虫尸剂由南开大学生命科学学院提供，每株烟苗放置2头虫尸，约含2×105条感染期线虫。

绿僵菌：金龟子绿僵菌颗粒剂(CQMa421)含2亿活孢子/g(购自重庆聚立信生物工程有限公司)，每株烟苗施用4.5 g(即5 kg/667 m2)。

化学农药：敌杀死的有效成分为25 g/L溴氰聚酯乳油(德国拜耳公司产品)，用量4 mL/667 m2，兑15 kg水，即每株烟喷14 g。烟用肥料包括复合肥(N ∶P2O5∶K2O=12 ∶6 ∶24)移栽时施用15 g/株(即16.5 kg/667 m2)、钙镁磷肥(P2O5含量14%～18%)6.5 g/株(即7 kg/667 m2)。

诱食剂：供试的小地老虎幼虫食物分别为小白菜B.chinensis(A)、蕹菜Ipomoeaaquatica(B)、人工饲料(C)和含水量60%的麸皮(D)。小白菜、蕹菜和麸皮均购自市场，小白菜、蕹菜用清水清洗后晾干，经饲喂实验未发现含有高毒化学农药残留。人工饲料配方同上。

1.3 小地老虎幼虫对食物偏好性测定

实验室饲养的小地老虎4龄幼虫用于本实验。食物分别为小白菜(A)、蕹菜(B)、人工饲料(C)和含水量60%的麸皮(D)。人工饲料配方同上。将小白菜和蕹菜以无菌水清洗并晾干，剪碎；将4种食物(约2 g)分别放置于玻璃培养皿(直径=15 cm)的4个对角上；每皿移入10头小地老虎4龄幼虫，设置5个培养皿的重复；每30 min观察并记录分别选择4种食物的小地老虎幼虫数量，统计不同时间每种食物引诱幼虫数量的百分率。

1.4 昆虫病原线虫等对移栽烟苗的保护作用

试验实施前，以小地老虎成虫性诱捕器(北京中捷四方生物科技股份有限公司产品)检查实验烟田的小地老虎发生情况。实验期间，早中晚分别测量和记录气温和土温。实验在下午黄昏时进行，以避免强光和高温对昆虫病原线虫或绿僵菌等的伤害。烟苗移栽前，将烟塘挖好(宽度45 cm；深度15 cm)。每塘浇定根水2.5 L，待水还未全部被沙土吸干前，明水深栽一株烟苗。待定根水全部落完后，取15 g烟用肥料在以每烟苗为圆心5 cm的区域进行环施。粉剂(使用前将保存的昆虫病原线虫粉剂用水溶解并稀释为浓度2×104/mL条感染期线虫的悬浮液)处理，以每烟苗为圆心8 cm的区域分别环浇10 mL昆虫病原线虫悬液；虫尸处理以每烟苗为圆心8 cm的区域放置2头被S.feltiaeSN感染的大蜡螟幼虫虫尸；绿僵菌处理撒施绿僵菌颗粒剂；化学农药处理喷施农药敌杀死(溴氰菊酯)于烟苗根部；食物处理小区取10 g小地老虎诱食剂以每烟苗为圆心8 cm的区域进行环撒后再分别施用线虫悬液、虫尸、绿僵菌和清水。然后，以每烟苗为圆心12 cm的区域对角加入2头或三角加入3头人工饲养的小地老虎4龄幼虫，用细干土(土温不超过25℃)进行盖塘(约0.5 cm土层)。实验按照随机区组设计，每个处理设3个重复，每个重复45株，共135株。

每天观察记录烟苗危害情况，连续10 d。将大蜡螟1头末龄幼虫放在一个金属茶漏里，移栽后3 d和10 d，每个小区随机选取5株烟苗，每株烟苗在施用线虫的圆圈上均匀放置10头大蜡螟幼虫，4 d后取出，查看大蜡螟死亡数量并解剖查看是否存在线虫。实验后第3天、第6天和第9天，各个处理和对照随机取3株样品，以取样器或勺子从环撒线虫的土层取一勺子土(约10 g)，准确称重后，于100℃烘箱中将土壤干燥至恒重，计算土壤含水量。

1.5 数据分析

对数据进行开方根反正弦转换，利用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析。符合正态分布(Normality Plots with Tests)和方差齐性(Test of Homogeneity of Variances)的数据进行单因素方差分析(One Way ANOVA)；重复测量数据先经球形检验(Mauchly’s test of sphericity)，如果检验结果P>0.05, 说明重复测量数据之间不存在相关性，测量数据符合Huynh-Feldt条件。若方差存在显著差异，则采用Tukey法进行多重比较。对于不符合上述条件的数据则进行非参数检验(Kruskal-Wallis test followed by the Mann-Whitney U test检验)。显著水平设置为P=0.05。

2 结果与分析

2.1 小地老虎幼虫对食物的选择作用

小地老虎幼虫于不同时间对食物的选择作用测定数据需要重复测量方差分析。经球形检验(Mauchly’s test of sphericity)，检验结果P=0.072>0.05，说明重复测量数据之间不存在相关性。结果分析见图1。测定后0.5 h，取食小白菜和蕹菜的小地老虎幼虫数量显著高于取食人工饲料和麸皮的幼虫数量(H=15.487,P=0.001)；1 h后，取食小白菜和蕹菜的小地老虎幼虫数量显著高于取食人工饲料和麸皮的幼虫数量，但取食人工饲料的幼虫数量又显著高于取食麸皮的(H=15.305,P=0.002)；2 h后，取食小白菜、蕹菜和麸皮的小地老虎幼虫数量显著高于取食人工饲料的幼虫数量(F3,16=10.319,P=0.001)；3 h后，取食小白菜和蕹菜的小地老虎幼虫数量显著高于取食人工饲料的幼虫数量(F3,16=10.559,P=0.000)；6 h后，取食小白菜和蕹菜的小地老虎幼虫数量显著高于取食人工饲料和麸皮的幼虫数量(F3,16=23.519,P=0.000)；8 h后，取食蕹菜的小地老虎幼虫数量显著高于取食白菜、人工饲料和麸皮的幼虫数量(H=15.949,P=0.001)。综上所述，尽管不同时间每种食物引诱的幼虫数量有差异，但是小地老虎幼虫对鲜叶类蔬菜小白菜和蕹菜具有偏好性。

2.2 昆虫病原线虫对移栽烟苗的保护作用

试验期间未有降雨，气温范围为17～31℃；5 cm和 10 cm下的土温范围分别为19～34℃和19～30℃。当每株烟苗放置2头小地老虎4龄幼虫时，10 d后不同处理和对照的烟苗累计被害率见图2。未加入小地老虎幼虫食物的情况下，施用昆虫病原线虫粉剂后的烟苗死亡率为56.7%，显著低于绿僵菌74.2%、昆虫病原线虫虫尸剂70.0%和对照78.3%，但高于敌杀死(溴氰菊酯)处理的烟苗死亡率37.5%；加入小地老虎幼虫食物后，可见小地老虎幼虫停留于食物上取食，施用昆虫病原线虫粉剂后的烟苗死亡率为40.8%显著低于绿僵菌62.5%、昆虫病原线虫虫尸剂67.6%和对照62.5%，但与敌杀死(溴氰菊酯)处理的烟苗死亡率39.2%差异不显著(F9,20=29.094;P=0.000)。相比之下，加入小地老虎幼虫食物后，施用昆虫病原线虫粉剂处理的烟苗死亡率为40.8%显著低于未添加幼虫食物的烟苗死亡率56.7%。

当每株烟苗放置3头小地老虎4龄幼虫时，10 d后不同处理和放置2头小地老虎幼虫处理的烟苗累计被害率结果类似，只是各处理和对照的烟苗死亡率比放置2头小地老虎幼虫时普遍提高10%～20%(图2)。不论是否加入小地老虎幼虫诱食剂，施用昆虫病原线虫后的烟苗死亡率均显著低于绿僵菌、虫尸剂或对照的，但与敌杀死(溴氰菊酯)处理的烟苗死亡率未见显著差异(F9,20=25.249;P=0.000)。同样，加入小地老虎幼虫食物后，施用昆虫病原线虫的烟苗死亡率为36.7%，显著低于未加入小地老虎幼虫食物的处理71.7%。

图2 不同处理的烟苗死亡率Fig.2 Mortalities of the young tobacco seedings注：Steinernema carpocapsae All粉剂(A)、S. feltiae SN虫尸剂(B)、绿僵菌Metarhizium anisopliae(C)或化学农药敌杀死(溴氰菊酯)(D)处理小地老虎幼虫后烟田移栽期烟苗的死亡率。E为对照。添加食物(鲜草)时的处理分别标记为A-1，B-1，C-1，D-1和E-1。图1-A，当每株烟苗存在2头小地老虎幼虫时；图1-B，当每株烟苗存在3头小地老虎幼虫时。柱状图上不同字母表示处理间烟苗被危害率在5%水平差异显著。Note: Mortalities of the young tobacco seedings from the black cutworm larvae after treated by Steinernema carpocapsae All in vermiculite (A), S. feltiae SN in Galleria cadavers (B), Metarhizium anisopliae (C) or chemical insecticide (deltamethrin) (D) in the tobacco field. E, the control. A-1, B-1, C-1, D-1 and E-1 indicated the treatments with attractant food (cut fresh weeds). A, two black cutworm larvae were present in a tobacco seeding; B, three black cutworm larvae were present in a tobacco seeding. Columns with different letters indicated significant differences in the mortalities of the young tobacco seedings at 0.05 level.

由此可见，每株烟苗施用2×105条感染期线虫，10 d的保苗效果高于60%，与敌杀死(溴氰菊酯)效果相当。说明昆虫病原线虫粉剂对烟草幼苗期小地老虎具有明显的控害作用，从而对烟草幼苗具有较好的保护作用。且2×105条感染期线虫的批量生产成本约为0.1元，与一株烟苗的成本相当，同时节省烟苗被害后补苗的人工费用，因此，在经济上是可行的。

为检测试验期间土壤的含水量和昆虫病原线虫的存活情况，每天通过水分测定仪测定烟塘表面土层的含水量，其范围为10.99%～37.95%；以末龄大蜡螟幼虫检测施用昆虫病原线虫10 d后的存活情况，结果表明，86.37%大蜡螟幼虫被昆虫病原线虫感染。如果为昆虫病原线虫持效期的测定，建议可将测定时间延长，10 d的时间设置较短。

3 结论与讨论

政策和市场驱动的烟草行业绿色化发展战略业已实施。关键是如何从技术上促进战略目标的实现。影响现代烟草行业绿色发展的主要因素之一是烟叶虫害防控过程中的化学农药残留。小地老虎、烟青虫Heliothisassulta、斜纹夜蛾Spodopteralitura是烟区主要害虫，施用化学农药是目前烟草虫害的主要防控手段(周孚美等, 2018)。利用生物农药防控烟区虫害是绿色之选(Yanetal., 2014)。昆虫病原线虫便是本研究的选择之一。试验证明，烟苗周围存在2或3头小地老虎4龄幼虫的情况下，施用S.carpocapsaeAll线虫粉剂对刚移栽烟苗具有保护作用，在刚移栽烟苗周围添加食物显著降低烟苗的被危害率。

小地老虎幼虫活动力很强，在烟田中很快便可找到刚移栽的烟苗并咬断其茎部(李根等, 2017)。由于生物制剂作用时间相对高毒化学农药缓慢，因此，有必要利用食物引诱小地老虎幼虫停留于施用生物制剂的区域，以便让小地老虎幼虫有足够时间被感染。本研究利用幼虫喜欢的鲜草或蔬菜距8 cm环绕烟苗，同时施用生物制剂，幼虫取食鲜草或蔬菜时可被昆虫病原线虫或绿僵菌感染。结果表明，添加食物和施用昆虫病原线虫粉剂可有效保护烟苗，同时，根据烟苗和线虫的成本核算，这一方法在经济上也是可行的。施用昆虫病原线虫粉剂保护烟苗的效果明显好于虫尸剂或绿僵菌，这可能与虫尸剂或绿僵菌需要更长的时间感染昆虫有关。

昆虫病原线虫虫尸剂是将被线虫感染的昆虫(一般为大蜡螟或黄粉虫Tenebriomolitor幼虫)尸体直接施用于田间防治害虫的剂型(Gaugleretal., 2002)。这种剂型可从虫尸中释放线虫，对静止性且发育周期长的昆虫(如蛴螬和韭蛆Bradysiaodoriphaga)具有防控优势(Shapiro-Ilanetal., 2001; Lewis & Shapiro-Ilan, 2002; Shapiro-Ilanetal., 2003; Del Valleetal., 2008; Wangetal., 2014; Baietal., 2016)，但对于活动性强、生活史比较短的昆虫(如小地老虎等)不适合，因为虫尸中的线虫还未及时释放出来时，昆虫幼虫可能业已离开虫尸放置区域。

真菌可用于田间防控小地老虎幼虫。球孢白僵菌Beauveriabrongniartii与多杀菌素混用防治小地老虎有协同增效作用，并能明显降低小地老虎幼虫的体重和大小(Gosselinetal., 2009)。卵孢白僵菌菌株NEAU30503对小地老虎具有较高的杀虫活性，土壤处理防治高龄幼虫效果好，对低龄幼虫需要加入少量的高效氯氢菊酯或茶皂素(刘聪鹤等, 2016)。中国拟青霉Paecilomycessinensis是冬虫夏草寄主昆虫蝙蝠蛾幼虫的一种病原真菌，也可用于致死小地老虎幼虫(张灿明等, 2018)。本实验使用绿僵菌保护移栽烟苗的效果不佳，主要原因同样是小地老虎幼虫活动能力太强，移栽时使用的绿僵菌未能及时感染幼虫，如果在翻犁或起垄前施用绿僵菌可能对移栽烟苗具有较好的保护作用。

昆虫根据挥发性气味对寄主或食物具有趋向性(Francisetal., 2004; Bruceetal., 2005; Carlssonetal., 2011)。如亚洲飞蝗Locustamigratoria对不同的寄主植物取食频数存在差异性(族米娜等, 2019)。本实验发现，在限制空间中存在小白菜、蕹菜、人工饲料和麸皮的情况下，小地老虎幼虫对小白菜和蕹菜具有明显偏好性。这为进一步筛选幼虫食物提供了思路，同时有助于研究引诱幼虫的挥发性物质。