洛阳江流域真核浮游生物多样性研究

黄卫红，李双彤，翁莉莉，柯玉森，曾武峰，张秋芳*

(1.泉州师范学院 海洋与食品学院，福建 泉州 362000；2.福建省海洋藻类活性物质制备与功能开发重点实验室， 福建 泉州 362000；3.泉州市洛江区河长办，福建 泉州 362011)

洛阳江起源于泉州市洛江区罗溪镇朴鼎山，依次流经罗溪镇、马甲镇、河市镇、双阳街道、万安街道，在下游汇入泉州湾，为福建省东南地区提供了重要水资源[1].微生物是水体生态系统中的重要组成部分，其中真核浮游生物对维持水体生态平衡具有重要的自净调节作用，可作为河流水域质量的重要评价指标[2-3].真核浮游生物群落相互关系及其与区域关系共同支配生态系统中能量流动和物质循环[4-5].真核浮游生物物种多样性结构对水体生态系统功能极为重要，能够直接反映出水体中氧含量、无机盐浓度和温度等因素[6-9].陈晓江等[10]发现，季节变化和环境因素改变均会对真核浮游生物群落产生影响，真核浮游生物达到最佳生长状态会使水体富营养化.近年，人类活动对河流生态环境和生物多样性结构造成一定破坏，使得水体生态系统中真核浮游生物多样性减少，水体营养严重过剩[11-12].故对洛阳江真核浮游生物多样性及其与环境相关关系的研究具有重要意义.

为了探明洛阳江水域生态系统真核浮游生物组成、相对含量及其与环境因子之间的相关关系，本研究以18S rRNA基因为分子标记，采用Illumina miseq高通量测序技术对洛阳江流域6个代表性断面水体真核浮游生物多样性进行分析，同时对主要水质指标进行关联性分析，拟获得洛阳江流域主要水域真核浮游生物群落组成特征及其与环境因子的互作关系，为了解洛阳江水体微生物生态及其水质安全等提供科学依据.

1 材料与方法

1.1 样品采集

采集洛阳江流域从源头到泉州湾入海口范围的6个具代表性断面水体样品，采样点均用GPS定位系统定位，水样采集点详见表1.每个采样点用1.0 L有机玻璃采水器采集表层(水下30 cm)水样3.5 L，其中:取1.0 L水样用于总DNA提取，2.5 L用于水质指标分析.

表1 洛阳江流域水样采集点位置信息Tab.1 Water sampling sites information of Luoyang River

1.2 样品采集水质理化参数分析

分别对水样中酸碱度(pH)、氨氮(NH3-N)、总氮(TN)、化学需氧量(CODMn)、总磷(TP)、叶绿素a(Chla)等主要水质指标进行检测.pH采用pH计法测定；NH3-N测定采用萘钠氏试剂分光光度法[13]；TN采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法测定[14]；CODMn采用高锰酸钾法测定[15]；TP采用钼酸铵分光光度法测定[16]；Chla含量采用分光光度法测定.

1.3 样品采集 样品总DNA提取

用0.22 μm水系微孔滤膜(Merck Millipore公司，美国)对水样进行抽滤，将收集有微生物的滤膜充分剪碎，FastDNA Spin Kit For Soil试剂盒(MP Biomedicals公司，美国)和核酸提取仪(MP Biomedicals公司，美国)用于提取总DNA，均质条件为18 s和4.5 m/s，提取步骤参照说明书进行.将获得的总DNA用70 μL DES溶液收集，经核酸测定仪测定DNA浓度和纯度后储存于-80 ℃下备用.

1.4 样品采集PCR扩增及测序

带Barcode序列[17]的引物对817f/1196r[18]用于18S rRNA基因样品总DNA的PCR扩增，引物序列为817f：5′-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3′和1196r：5′-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3′.扩增条件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，54 ℃30 s，72 ℃ 45 s(35个循环)；72 ℃10 min.PCR产物经琼脂糖凝胶电泳验证后，取足够量送至上海美吉生物医药科技有限公司，在Illumina Miseq平台上测序.

1.5 样品采集数据分析

去除原始序列中引物序列与Barcode序列，得到的PE-reads，利用Flash软件[19]拼接，并用QⅡME v.1.7.0软件进行分析[20].运用Uclust软件[19]以97%的阈值进行OTU(Operational Taxonomic Unit)划分后，实现对序列的聚类.RDP(Ribosomal Database Project)Classifier软件[21]和SILVA数据库[22]用于注释每个OTU序列的分类信息.利用Mothur v1.30.1软件对相似性高于97%的OTUs进行包括覆盖率(Coverage)、丰富度(Chao)和多样性(Shannon)在内的α-多样性指数分析，物种韦恩(Venn)图、群落组成、β-多样性和环境因子相关性等分析[23]均由R语言软件完成.FUNGuild v1.0 软件用于真核微生物的功能预测[24].获得的18S rRNA基因的DNA序列已收录于NCBI的Sequences Read Archive(SRA)，登录号为SRP127554.

2 结果与分析

2.1 样品采集水质分析

洛阳江流域各断面水体水质指标如表2所示.后坂水库(HB)和惠女水库(HN)水质呈碱性，福滨街桥(FB)为弱酸性水质，前后埭交界处(QHD)和和洛阳桥(LY)水质呈弱碱性，杏宅水闸(XZ)水质呈中性；6个断面水体TN值具有一定差异，其由高到低依次为杏宅水闸(XZ)、洛阳桥(LY)、前后埭交界处(QHD)、惠女水库(HN)、福滨街桥(FB)和后坂水库(HB)，其中后坂水库(HB)TN值最低(0.04 mg/L)；根据《国家地表水环境质量标准》中TN含量的限值，后坂水库(HB)和前后埭交界处(QHD)的水质类别为Ⅰ类水，惠女水库(HN)和福滨街桥(FB)为Ⅱ类水，而洛阳桥(LY)和杏宅水闸(XZ)的水质类别分别为Ⅲ类和Ⅳ类.NH3-N含量和TP最高均为杏宅水闸(XZ)，其次是福滨街桥(FB)和前后埭交界处(QHD)，水库和入海口NH3-N含量和TP则相对较低.根据《国家地表水环境质量标准》中NH3-N含量的限值，后坂水库(HB)、惠女水库(HN)、福滨街桥(FB)和洛阳桥(LY)的水质类别均为Ⅱ类，前后埭交界处(QHD)和杏宅水闸(XZ)的水质类别分别为Ⅲ类和Ⅳ类；根据《国家地表水环境质量标准》中TP含量的限值，后坂水库(HB)、惠女水库(HN)和洛阳桥(LY)均为Ⅰ类水，前后埭交界处(QHD)为Ⅱ类水，福滨街桥(FB)和杏宅水闸(XZ)均为Ⅲ类水.洛阳桥(LY)CODMn值达到11.0 mg/L，除洛阳桥(LY)外，其他5个断面水体CODMn值差异较小；根据《国家地表水环境质量标准》中CODMn含量的限值，除洛阳桥(LY)为Ⅴ类水外，其他5个断面水体的水质类别均为Ⅱ类.对比各断面水体Chla值可知，前后埭交界处(QHD)叶绿素a含量最高，而福滨街桥(FB)叶绿素a含量最低.

表2 洛阳江流域不同水样采集点水质指标及评价Tab.2 Water quality index and evaluation of Luoyang River at the different water sampling sites

2.2 α-多样性分析

洛阳江不同水样采集点α-多样性指数见表3.由表可知，洛阳江流域6个断面水体中微生物Coverage指数均大于0.99，说明样品中绝大多数DNA序列被测出，即测序深度可以反应出样品中微生物的真实情况.就OTU数量而言，6个断面水体真核浮游生物OTU总数差异较大，惠女水库(HN)、福滨街桥(FB)和杏宅水闸(XZ)OUT数目较高，前后埭交界处(QHD)、后坂水库(HB)、洛阳桥(LY)OUT数目较低；就Chao指数而言，福滨街桥(FB)Chao指数最大，惠女水库(HN)和杏宅水闸(XZ)相对次之，而洛阳桥(LY)的Chao指数最小；6个断面水体Shannon指数具有一定差异，惠女水库(HN)的Shannon指数最高，而后坂水库(HB)的Shannon指数最低.以上可以得出，真核浮游生物丰富度最高的是福滨街桥(FB)，其次是惠女水库(HN)，最低的是洛阳桥(LY)；真核浮游生物多样性最好的是惠女水库(HN)，其次是福滨街桥(FB)，而处于洛阳江流域源头的后坂水库(HB)真核浮游生物多样性最差.结合水体理化指标结果分析可知，真核浮游生物多样性与氮素有较大的关联性，氮素与众多水生微生物显著正相关，而后坂水库(HB)的TN含量和NH3-N含量均为最低，导致了该断面水体的真核浮游生物多样性最差.

表3 洛阳江不同水样采集点α-多样性指数Tab.3 α-diversity index of Luoyang River at the different water sampling sites

图1 OTU水平下洛阳江水库(WR)、河流(RR) 和入海口(ER)3个小组真核浮游生物韦恩图Fig.1 Venn diagram of eukaryotic plankton OTU number of Luoyang River in three groups of reservoir (WR), river (RR) and estuary(ER)

2.3 物种Venn图分析

根据洛阳江流域的水域位置和功能特点，将6个断面水体划分成水库(WR)、河流(RR)和入海口(ER)3个小组.其中水库(WR)包括后坂水库(HB)和惠女水库(HN)，河流(RR)包括福滨街桥(FB)、前后埭交界处(QHD)和杏宅水闸(XZ)，入海口(ER)包括洛阳桥(LY).由图1Venn图可知，3个小组总共OTU数量为212个.其中3个小组共有32个OTU；水库(WR)和河流(RR)共有102个OTU，说明二者物种组成最为相似性；水库(WR)、河流(RR)和入海口(ER)特有的OTU数分别为27、47和23，说明各自的物种组成均具独特性，相比较而言河流(RR)物种组成更为独特.水体中高含量的TP可能是导致河流(RR)物种组成更为特殊的重要因素，组成河流(RR)的3个断面水体TP含量明显高于水库(WR)和入海口(ER)，过量的TP使河流(RR)水域中包括藻类等不同种类真核浮游生物得以大量繁殖，从而造成该水域物种组成更为独特.

2.4 结构组成分析

洛阳江流域6个断面水体中真核浮游生物种类为33个门、46个纲、60个目、71个科、100个属，不同断面水体真核浮游生物种类和相对含量不同.图2为门水平下相对丰度大于1%优势物种，其他物种合并为others.后坂水库(HB)优势物种主要有隐藻类(Cryptomonadales，81.2%)和纤毛门(Ciliophora，5.9%)；惠女水库(HN)优势物种主要有隐藻类(Cryptomonadales，31.5%)、领鞭毛类(Choanoflagellida，16.3%)、真核域未分类门(unclassified_d_Eukaryota，13.6%)、壶菌门(Chytridiomycota)、P1-31门(P1-31，8.3%)、子囊菌门(Ascomycota，7.1%)和纤毛门(Ciliophora，6.2%)；福滨街桥(FB)优势物种主要为子囊菌门(Ascomycota，44.1%)、纤毛门(Ciliophora，32.3%)、隐藻类(Cryptomonadales，12.2%)和隐真菌门(Cryptomycota，5.1%)；前后埭交界处(QHD)优势物种主要为纤毛门(Ciliophora，60.7%)、隐藻类(Cryptomonadales，27.6%)和真核域未分类门(unclassified_d_Eukaryota，4%)；杏宅水闸(XZ)优势物种主要为隐藻类(Cryptomonadales，52.8%)、纤毛门(Ciliophora，41.1%)和真核域未分类门(unclassified_d_Eukaryota，4.6%)；洛阳桥(LY)主要优势物种为纤毛门(Ciliophora，85.0%)和隐藻类(Cryptomonadales，11.8%).6个断面水体共有的优势物种为纤毛门和隐藻类，这两类真核浮游生物是河流中常见浮游生物群落.后坂水库(HB)到入海口洛阳桥(LY)的纤毛门浮游生物含量呈递增趋势，其中后坂水库(HB)和惠女水库(HN)变化较小，福滨街桥(FB)到洛阳桥(LY)变化相对显著.隐藻类浮游生物含量最高为后坂水库(HB)，最低为洛阳桥(LY).惠女水库(HN)和福滨街桥(FB)含有含量较高的子囊菌门，说明子囊菌门浮游生物在二者的水体生态系统中具有一定的特殊功能.此外，惠女水库(HN)优势物种种类最多且相对丰度比较平均，说明其真核浮游生物群落组成较为均衡.

图3显示属水平下相对丰度大于1%的优势物种，其他物种合并为others.后坂水库(HB)、惠女水库(HN)、福滨街桥(FB)、前后埭交界处(QHD)和杏宅水闸(XZ)的隐藻属(Cryptomonas)相对丰度均大于10%，洛阳桥(LY)中隐藻属相对丰度小于1%；其中后坂水库(HB)隐藻属相对丰度最大为80.9%，其次是前后埭交界处(QHD)和惠女水库(HN)，相对丰度分别为51.4%和31.3%.说明隐藻属最适生长环境为水质较好的水体.散毛亚纲分类不明属(norank_f_Choreotrichia)为杏宅水闸(XZ)和洛阳桥(LY)的主要优势物种，相对丰度分别达到59.6%和58.7%.下游的杏宅水闸(XZ)和洛阳桥(LY)水质状况低于上游水库，说明隐藻属和散毛亚纲分类不明属是河流水质状况好坏的重要指标.筒壳虫属(Tintinnidium)是前后埭交界处(QHD)和福滨街桥(FB)的特有优势物种，相对丰度分别为37.8%和14.6%.酵母目未分类属(unclassified_o_Saccharomycetales)单独存在于福滨街桥(FB)，该类微生物在河流中的作用主要是分解糖类等有机物，为其他微生物提高营养物质.由此可知，福滨街桥(FB)中存在丰富的有机物质.惠女水库(HN)门水平和属水平下的优势物种种类较多，优势物种均匀度较好，说明其水体生态系统的结构较为稳定.

图2 门水平下洛阳江6个水样采集点真核浮游生物群落结构Fig.2 Eukaryotic plankton communities of Luoyang River in six water sampling at the phylum level

图3 属水平下洛阳江6个水样采集点真核浮游生物群落结构Fig.3 Eukaryotic plankton communities of Luoyang River in six water sampling at the genus level

2.5 β-多样性分析

层级聚类分析可以直观地将采样点物种组成相似或差异程度反映在层级聚类树图上，如果物种组成越相似，在层级聚类树图中距离数值就越接近.如图4所示，6个采样点间都相差一定距离，说明真核浮游生物群落组成都有一定差异.其中，后坂水库(HB)和前后埭交界处(QHD)优先聚类，说明二者真核浮游生物群落差异程度最小，其次是惠女水库(HN)和前后埭交界处(QHD)；后坂水库(HB)和惠女水库(HN)真核浮游生物群落组成也较为相近；洛阳桥(LY)与其他5个采样点的差距明显，说明其真核浮游生物群落组成与其他5个采样点之间差异显著.由以上可知，洛阳江流域入海口的真核浮游生物群落组成与水库和河流区域有明显区别.

图4 OTU水平下洛阳江不同水样采集点真核浮游生物群落层级聚类分析Fig.4 Eukaryotic plankton communities hierarchical clustering analysis of Luoyang River in different water sampling sites at the OTU level

2.6 真核浮游生物多样性与环境因子相关性分析

图5 门水平下洛阳江不同水样采集点真核浮游生物群落多样性与环境因子相关性热图Fig.5 Spearman correlation heatmap of Luoyang River in different water sampling sites of eukaryotic plankton communities diversity and environmental factors at the phylum level

图6 洛阳江不同水样采集点真核浮游生物群落 的FUNGuild功能预测分析Fig.6 Eukaryotic plankton communities FUNGuild function predictive analysis of Luoyang River in different water sampling sites

2.7 FUNGuild功能预测分析

洛阳江不同断面水体真核浮游生物群落的FUNGuild功能预测如图6所示.其中惠女水库(HN)和福滨街桥(FB)真核浮游生物的营养型和功能群落组成较为特殊，分别含有相对丰度为6.7%和42.7%的未定义腐生营养型微生物(Undefined Saprotroph).腐生营养型微生物是河流中重要分解者，能够将河流中大部分动植物分解为无机碳和无机氮等物质，从而起到净化水体的作用.惠女水库(HN)和福滨街桥(FB)中未定义腐生营养型微生物与特有优势物种子囊菌门含量较为一致，说明这两个断面水体中未定义腐生营养型微生物可能对应的是子囊菌门下的真核浮游生物群落.

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