抗性淀粉饮食模式下L-茶氨酸对大鼠肠道免疫功能的调节作用

屈青云 许 伟 胡 源 李银花 龚志华 肖文军,2

(1. 湖南农业大学茶学教育部重点实验室，湖南 长沙 410128；2. 湖南农业大学国家植物功能成分利用工程技术研究中心，湖南 长沙 410128)

肠道是机体消化吸收营养物质的场所，也是重要的免疫器官，肠道免疫功能的提高对维持内环境自稳衡、提高机体抗病能力具有重要作用[1-2]。通过膳食营养干预来保护肠道完整性、减轻肠道炎症、维护肠道菌群微生态平衡已成为一种提高肠道免疫功能的有效途径[3-4]。随着人们生活水平的提高，采用多元化的营养素进行肠内营养是现代膳食营养的重要发展方向。研究[5]发现，谷氨酰胺联合膳食纤维强化肠内营养能较好地维持肠道正常适度的免疫反应，减轻过度的炎症反应，提高肠道黏膜免疫能力。其中，谷氨酰胺是肠道免疫重要关联物质，主要依靠其他器官合成或外源性摄入，可促进肠道细胞因子TNF-α、IL-6和IL-10的产生，对调节细胞免疫具有重要作用[6]；膳食纤维可在肠道微生物的作用下发酵形成短链脂肪酸(SCFAs)，其在肠道供能、改善肠道形态结构、增强肠道免疫功能等方面发挥积极作用[7]。

常见的膳食纤维主要有纤维素、半纤维素、果胶、树胶和木质素等[8]。抗性淀粉(RS)是一种极具潜力的新型膳食纤维，不仅在持水力、色泽、口感等方面拥有更好的性能，而且具有调节肠道pH值、预防结肠癌、改善肠道菌群和提高肠道免疫力等作用[9-10]。但抗性淀粉的长期摄入对肠道内环境的积极作用会逐渐减弱，且由于RS在小肠中不易被酶消化，其在肠道中的存在也会影响肠道内容物的物理特性，从而改变小肠消化和营养吸收的程度[11]。L-茶氨酸(L-theanine)是茶叶中一种特征性氨基酸，与谷氨酰胺结构类似，不仅可以作为一种外源营养补充物质，同时可通过改善肠道结构、促进免疫球蛋白分泌、降低白介素含量、下调炎症因子水平等途径提高肠道免疫力[12]，此外，氨基酸发酵也可产生大量的SCFAs[13]。由此可见，抗性淀粉与L-茶氨酸均有利于肠道健康，但其组合营养是否具有协同增效作用还有待进一步探究。为此，试验拟通过不同剂量L-茶氨酸灌胃干预抗性淀粉饮食模式下的SD雄性大鼠28 d，研究分析抗性淀粉和L-茶氨酸的组合肠内营养对大鼠肠道免疫功能的调节作用，以期为食品营养干预多元化发展、改善肠道免疫功能以及L-茶氨酸的深层次利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

L-茶氨酸：纯度≥98%，湖南三福生物科技有限公司；

抗性淀粉II(商标号：Fibersol-2)：上海友山生物科技有限公司；

抗性淀粉饲料：参照文献[14]了解抗性淀粉的功能及营养配比后，委托湖南斯莱克景达实验动物有限公司，在基础饲料配方上添加抗性淀粉II制成，其组成：2%抗性淀粉II，18%蛋白质(供能比24.7%)，58%碳水化合物(供能比67.1%)，4.8%脂质(供能比8.2%)和3%矿物质；

谷氨酰胺(Gln)、白介素-4(IL-4)、白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、免疫球蛋白A(IgA)ELISA试剂盒：上海茁彩生物科技有限公司；

谷氨酸(Glu)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)、诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)试剂盒：南京建成生物工程研究所；

SD雄性大鼠：SPF级4周龄，湖南斯莱克景达实验动物有限公司。

1.2 主要仪器设备

多功能酶标仪：Varioskan Flash型，赛默飞世尔上海仪器有限公司；

台式冷冻离心机：MIKRO22R型，德国Hettich公司；

移液枪：Reerach Plus型，德国Eppendorf公司；

全自动样品快速研磨仪：JXFSTPRP-48型，上海净信实业发展有限公司；

紫外可见分光光度计：UV-2550型，日本Shimadzu公司。

1.3 方法

1.3.1 动物试验设计 所有涉及动物的试验程序严格按照湖南农业大学伦理委员会《动物护理和使用指南》进行(注册号：015063506)。试验动物选择SPF级4周龄SD雄性大鼠，饲养条件：温度(25±2)℃、湿度(50%～70%)，12 h的光/暗周期，保持动物房空气流通。大鼠分组前适应性喂养1周，期间自由进食饮水。

将50只大鼠按体重随机分为基础饲料对照组(CK A)、抗性淀粉饲料对照组(CK B)和L-茶氨酸低剂量组(LTA 100)、中剂量组(LTA 300)、高剂量组(LTA 500)共5组，每组10只，喂养周期为28 d，大鼠分组及喂养如表1所示。

1.3.2 样品采集与检测 末次灌胃后，经禁食12 h，收集各组大鼠粪便，置于干燥的灭菌试管中，随后注射戊巴比妥钠溶液麻醉大鼠，解剖收集每只大鼠的十二指肠、空肠、回肠组织，粪便与肠道组织均-80 ℃贮藏备用。试验指标检测严格按照试剂盒操作。

1.3.3 肠道微生物DNA提取与测序 使用EZNA Soil DNA试剂盒对大鼠粪便进行总DNA抽提，使用特异引物对粪便中细菌16S rDNA的V3-V4可变区进行PCR扩增、纯化，以及文库模板的富集和测序文库的构建，随后在Illumina Miseq PE300平台上进行测序。

表1 大鼠分组及喂养Table 1 The grouping and feeding of rats

测序数据经使用Trimmomatic软件质控、FLASH拼接、Verseach过滤得到优质序列，利用软件Uparse对所有样品的有效数据进行聚类，将具有97%一致性序列聚类成为操作单元(OTUs)，采用RDP Classifier对OTUs代表序列进行分类和注释，与Silva(SSU123)数据库进行比对，置信水平设置为70%。基于样品OTUs结果，使用Mothur软件对样品进行Alpha多样性分析，并在门与属分类水平上，进行肠道菌群结构分析。

1.3.4 统计分析方法 试验数据以平均值±标准差表示，采用SPSS 25.0进行统计分析，数据采用单因素方差分析(ANOVA)，最小显著差数法(LSD)和邓肯(Duncan)检验，P<0.05时为具有统计学显著性差异。使用GraphPad Prism 8.0.1软件作图。

2 结果与分析

2.1 抗性淀粉饮食模式下L-茶氨酸对大鼠体重与采食量的影响

表2显示，各处理组日均采食量无显著差异(P>0.05)。与CK A组相比，CK B组大鼠体重稍下降(P>0.05)，可能与抗性淀粉降低机体脂肪沉积量有关[15]。与CK B组相比，LTA 300、LTA 500组大鼠体重变化量显著增加(P<0.05)，说明抗性淀粉饮食模式下L-茶氨酸能促进大鼠生长，与童海鸥等[16]的结论基本一致。

2.2 抗性淀粉饮食模式下L-茶氨酸对大鼠回肠组织酶活性及MDA含量的影响

如图1所示，与CK A组相比，CK B组大鼠回肠组织中SOD、GSH-Px活性升高，iNOS活性和MDA含量降低，其中iNOS达到显著水平(P<0.05)。与CK B组相比，LTA 300、LTA 500组均能增加大鼠回肠组织中SOD、GSH-Px活性(P<0.05)，降低MDA含量(P<0.05)。由于肠道系统不仅是代谢部位，也是宿主和微生物之间的作用位点，肠道细胞新陈代谢、日粮成分氧化、肠道微生物改变等均会影响肠道氧化与抗氧化系统的平衡[17]。由此说明抗性淀粉饮食模式下L-茶氨酸能提高SOD、GSH-Px活性，抑制iNOS活性及减少MDA形成来平衡肠道自由基，维护肠道健康。

表2 抗性淀粉饮食模式下L-茶氨酸对大鼠体重变化量与日均采食量的影响†Table 2 Effects of L-theanine on the weight change and average daily feed intake of rats under resistant starch feeding g

小写字母不同表示差异显著(P<0.05)图1 抗性淀粉饮食模式下L-茶氨酸对大鼠回肠组织中SOD、GSH-Px、iNOS活性和MDA含量的影响Figure 1 Effects of L-theanine on SOD,GSH-Px,iNOS activities and MDA content in ileum of rats under resistant starch feeding

2.3 抗性淀粉饮食模式下L-茶氨酸对大鼠回肠细胞因子表达水平的影响

由图2可知，与CK A组相比，CK B组大鼠回肠IL-4、IL-10表达量显著升高(P<0.05)，IL-6、TNF-α表达量显著降低(P<0.05)，说明抗性淀粉可通过改善炎症因子水平来平衡肠道稳态，与曹承嘉[18]的研究结果相符。与CK B组相比，各L-茶氨酸剂量组IL-4、IL-10表达量显著升高(P<0.05)，IL-6、TNF-α表达量显著降低(P<0.05)，说明在抗性淀粉饮食模式下，L-茶氨酸干预可进一步调节促炎/抗炎因子平衡，且具有剂量依赖效应。

小写字母不同表示差异显著(P<0.05)图2 抗性淀粉饮食模式下L-茶氨酸对大鼠回肠中细胞因子表达量的影响Figure 2 Effects of L-theanine on the levels of cytokines in ileum of rats under resistant starch feeding

2.4 抗性淀粉饮食模式下L-茶氨酸对大鼠回肠IgA的影响

由图3可知，与CK A组相比，CK B组大鼠回肠IgA含量显著增加(P<0.05)。与CK B相比，各L-茶氨酸剂量组IgA含量显著升高(P<0.05)，其中，以LTA 300组效果最佳，由此提示抗性淀粉饮食模式下L-茶氨酸能通过促进IgA分泌增强肠道免疫应答[19]。

2.5 抗性淀粉饮食模式下L-茶氨酸对大鼠肠道Glu、Gln的影响

由表3可知，与CK A组相比，CK B组肠道Glu、Gln的含量降低，且空肠和十二指肠达到显著水平(P<0.05)，可能与抗性淀粉降低肠道氮的吸收和促进大肠微生物发酵而增加微生物蛋白质合成有关[20]，同时回肠Glu、Gln含量有所降低，但并不显著(P>0.05)，可能是抗性淀粉在小肠后段消化率较高的缘故[21]。与CK B组相比，不同剂量的L-茶氨酸干预均增加了肠道Glu、Gln的含量，其中LTA 100组十二指肠、空肠Gln，LTA 300组十二指肠、空肠Glu以及十二指肠、空肠、回肠Gln，LTA 500组十二指肠、空肠、回肠中Glu和Gln含量达到显著水平(P<0.05)，说明抗性淀粉饮食模式下L-茶氨酸干预能提高肠道Glu和Gln的含量，一方面可能是由于L-茶氨酸能改善肠道形态结构并促进肠道营养吸收[22]，另一方面，L-茶氨酸降解可增加Gln合成底物Glu的浓度，并通过提高骨骼肌中谷氨酰胺合成酶活性和促进肠道谷氨酰胺酶蛋白的翻译和修饰影响肠道Gln代谢[12]。

小写字母不同表示差异显著(P<0.05)图3 抗性淀粉饮食模式下L-茶氨酸对大鼠回肠中IgA含量的影响Figure 3 Effect of L-theanine on the content of IgA in ileum of rats under resistant starch feeding

表3 抗性淀粉饮食模式下L-茶氨酸对大鼠肠道Glu、Gln的影响†Table 3 Effects of L-theanine on the contents of Glu and Gln in intestinal of rats under resistant starch feeding μmol/g

2.6 抗性淀粉饮食模式下L-茶氨酸对大鼠肠道菌群的影响

如表4所示，5组样本的测序深度指数在99.70%～99.80%，说明测序深度足以反映样本中所包含的绝大多数序列，能进行下一步分析。LTA 500组ACE、Chao、Shannon指数最大，其中ACE指数与CK B组相比达到显著水平(P<0.05)，各L-茶氨酸剂量组Simpson指数显著降低(P<0.05)。由此提示，抗性淀粉联合L-茶氨酸进行营养干预能提高大鼠肠道微生物丰富度和多样性，进而影响肠道菌群组成。

原始测序结果经过质控优化后在分类学上共得到805个OTUs，可划分为13个门，19个纲，31个目，57个科，161个属，287个种。图4显示，各组样本在门水平上群落结构差异不大，主要由拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、螺旋体门(Spirochaetes)、ε-变形菌门(Epsilonbacteraeota)、变形菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)6个门构成，其中拟杆菌门和厚壁菌门占绝对优势，约占总序列数的90%，与Ericsson等[23]的研究结果一致。由图4及表5可知，与CK A组相比，CK B组厚壁菌门相对丰度下降，拟杆菌门相对丰度增加，二者比值有所上升(P>0.05)。拟杆菌门在碳水化合物发酵、含氮物质的利用、抵抗病原体定植和促进肠道菌群平衡等活动中发挥重要作用[24]，同时，拟杆菌门与厚壁菌门的比值与动物机体的能量代谢相关[25]。Kyu-Ho等[15]研究发现，高膳食纤维补充日粮能显著降低正常饮食大鼠肠道厚壁菌门与拟杆菌门的比值，与试验结果相符。与CK B组相比，L-茶氨酸各剂量组均能降低厚壁菌门，提高拟杆菌门的相对丰度，并降低其比值(P>0.05)，提示抗性淀粉饮食模式下L-茶氨酸可能具有调节宿主能量代谢的作用。

图5表明，在属的分类学水平上，5组样本中的主要优势菌属有普雷沃菌属9(Prevotella_9)、乳杆菌属(Lactobacillus)、副杆菌属(Parabacteroides)和鼠杆菌科未命名属(Muribaculaceae_norank)，4个属相对丰度占比50%以上，选取相对丰度前30位的属进行显著性差异分析，得到表6。由表6可知，与CK A组相比，CK B组副杆菌属、毛螺菌科未命名属(Lachnospiraceae_norank)、瘤胃梭菌属5(Ruminiclostridium_5)、木质真菌属([Eubacterium]_xylanophilum_group)、拟杆菌属(Bacteroides)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)和布劳特氏菌属(Blautia)丰度显著增加(P<0.05)，拟普雷沃氏菌属(Alloprevotella)、幽门螺杆菌属(Helicobacter)、副萨特氏菌属(Parasutterella)丰度显著降低(P<0.05)。而L-茶氨酸可进一步改善抗性淀粉饮食模式下的肠道菌群结构。与CK B组相比，LTA 300组显著上调副杆菌属，显著下调鼠杆菌科未命名属的相对丰度(P<0.05)；LTA 500组显著上调毛螺菌科NK4A136群属(Lachnospiraceae_NK4A136_group)和双歧杆菌属的相对丰度(P<0.05)；LTA 300、LTA 500组均能显著上调普雷沃菌属9和布劳特氏菌属，下调普雷沃菌科NK3B31群属(Prevotellaceae_NK3B31_group)、幽门螺杆菌属和副萨特氏菌属的相对丰度(P<0.05)。双歧杆菌属是一种常见益生菌，不仅能抑制有害细菌和炎症细胞因子分泌，还可改变树突状细胞的功能，以调节肠道对无害抗原和细菌的免疫稳态[26]；副杆菌属、普雷沃菌属9、布劳特氏菌属由于与免疫关联物质SCFAs的产生有关，被认为是益生菌或潜在益生菌。SCFAs是抗性淀粉在大肠内被肠道菌群发酵利用产生的主要代谢产物，包括乙酸、丙酸和丁酸等[27]。副杆菌属主要代谢终产物为有益的乙酸、丙酸，帮助调节肠道菌群[28]；普雷沃菌属9、布劳特氏菌属参与丁酸盐的产生，为肠道上皮细胞提供能源[29]。与CK A组相比，CK B组双歧杆菌属、副杆菌属、布劳特氏菌属等菌属丰度增加(P<0.05)，说明抗性淀粉能通过影响SCFAs产生而促进肠道有益菌的生长。与CK B组相比，LTA 300、LTA 500组普雷沃菌属9、副杆菌属、布劳特氏菌属丰度显著增加(P<0.05)，可能是L-茶氨酸能很好地被肠道微生物发酵利用，进而生成SCFAs[30]45-50，影响肠道内环境、促进肠道有益菌生长的原因。幽门螺杆菌属、副萨特氏菌属与肠道健康呈负相关，幽门螺杆菌属是一种慢性致病菌，定植在机体内易引起炎症[31]；副萨特氏菌属丰度增加会导致菌群紊乱，易引起肠易激综合征、科恩氏病[32]。表6中，与CK A组相比，CK B组幽门螺杆菌、副萨特氏菌等菌属丰度降低(P<0.05)，可能与抗性淀粉降低肠道pH值，抑制部分有害菌群生长有关[33]。与CK B组相比，LTA 300、LTA 500组幽门螺杆菌、副萨特氏菌丰度显著降低(P<0.05)，可能是由于L-茶氨酸能促进乳酸等SCFAs的生成[30]51，进一步降低肠道pH值。由此可知，抗性淀粉饮食模式下L-茶氨酸可通过提高肠道益生菌和潜在益生菌丰度、降低致病菌丰度来改善肠道菌群结构。

表4 抗性淀粉饮食模式下L-茶氨酸对大鼠肠道菌群丰富度及多样性的影响†Table 4 Effects of L-theanine on the richness and diversity of intestinal bacteria in rats under resistant starch feeding

图4 抗性淀粉饮食模式下L-茶氨酸对门水平上的大鼠肠道菌群结构的影响Figure 4 Effect of L-theanine on the structure of intestinal bacteria in rats at gate level under resistant starch feeding

表5 抗性淀粉饮食模式下L-茶氨酸对大鼠肠道菌群厚壁菌门与拟杆菌门相对丰度及其比值的影响Table 5 Effects of L-theanine on the relative abundance and ratio of Firmicutes and Bacteroidetes of intestinal bacteria in rats under resistant starch feeding

图5 抗性淀粉饮食模式下L-茶氨酸对属水平上的大鼠肠道菌群结构的影响Figure 5 Effect of L-theanine on the structure of intestinal bacteria in rats at genus level under resistant starch feeding

表6 抗性淀粉饮食模式下L-茶氨酸对大鼠肠道菌群优势属相对丰度的影响†Table 6 Effects of L-theanine on the relative abundance of intestinal bacteria in rats at main genus under resistant starch feeding

3 结论

试验表明，在抗性淀粉饮食模式下使用L-茶氨酸进行营养干预，一方面能够提高肠道抗氧化能力、平衡促炎/抗炎因子、提高肠道Glu与Gln含量，增强肠道免疫应答能力。另一方面，能够通过提高肠道菌群多样性、改善肠道菌群结构来增强肠道免疫功能，但其作用机制有待进一步探究。