荆芥多糖制备及对百合荆梨汁的抑菌效果

曹 阳 张丽芳 贾春凤

(1. 江苏食品药品职业技术学院，江苏 淮安 223003；2. 保定学院，河北 保定 070100)

荆芥(Schizonepeta)为唇形科[1]，是一种药食同源的植物，具有镇痛消炎、止血、去痰平喘、抗氧化等多项作用，主治咽喉肿痛、感冒发热、多种皮肤疾病等，为中医临床常用药物[2]，在食品中的应用鲜见报道。荆芥主要含有荆芥挥发油、薄荷酮、荆芥苷、黄酮、荆芥多糖等[3]，目前，荆芥挥发油是荆芥功能成分的主要研究对象[4-5]，对荆芥中多糖成分的研究较少。

近年来，天然抑菌剂的研发备受关注。资料[6-8]显示，很多植物多糖具有较好的抑菌活性。孙立卿等[9]曾研究了荆芥多糖的提取工艺，发现荆芥中多糖质量分数可高达13.41%。有资料显示，荆芥多糖不仅具有调节免疫功能的作用[10]，还具有一定的抗氧化功能[11]，具有较高的研发价值。但目前对荆芥多糖的抑菌功能未见相关报道。

试验拟探究荆芥多糖的提取工艺，并将其与具有润肺、消痰、止咳、降火、治风热等功能的雪花梨[12-14]，以及具有润肺止咳、美容养颜、宁心安神等功效的干百合花[15]按一定比例配置成饮品，考察荆芥多糖对此饮品的抑菌效果，以期为荆芥在食品中的应用提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

雪花梨：江苏省淮安市市售；

干百合花：芜湖四月茶侬茶叶有限公司(分装)；

荆芥：江苏省淮安市大药房；

干柠檬片：芜湖四月茶侬茶叶有限公司(分装)；

单晶体冰糖：保定市大众味业有限公司；

啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、青霉菌(P.notatum)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)：江苏食品药品职业技术学院微生物实验室保存；

牛肉膏：天津市德晟生物技术有限公司；

蛋白胨、氯化钠、葡萄糖：分析纯，天津市大茂化学试剂厂；

电子天平：JA2002型，上海精天电子仪器有限公司；

高压灭菌锅：YX-24LDJ型，江阴滨江医疗设备有限公司；

超净工作台：SW-CJ-2F型，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；

电热恒温培养箱：svp-01型，湖北省黄石市恒丰医疗器械有限公司；

可见分光光度计：722N型，上海棱光技术有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 工艺流程

(1)荆芥多糖制备：

荆芥→晒干→磨粉→称量→加水→加热→过滤→滤液→冷却→多糖提取液

(2)百合荆梨汁制备：

1.2.2 原材料样品制备

(1)雪梨汁：取新鲜雪花梨，清洗，去梗去核，切成1～2 cm的小块，称取100 g于1 000 mL白瓷缸中，加饮用水500 mL，加热至沸腾后再用小火熬制至250 mL。

(2)柠檬汁：称取干柠檬片15 g，加饮用水500 mL，加热至沸腾后，改用小火熬煮浓缩至250 mL。

(3)糖水：称取冰糖200 g，加水500 mL，加热至沸腾后，改用小火熬煮8 min，冷却至室温，分装于锥形瓶中，以4层保鲜膜及1层保鲜袋密封，放于冰箱冷藏备用(4 ℃)。

(4)百合雪梨汁：先按雪梨汁40%、糖水8%、柠檬汁1%配置好后，百合干花在此液中，按料液比1∶40 (g/mL)于80 ℃条件下浸泡20 min。

1.2.3 荆芥多糖制备 采用水提法。干燥荆芥粉碎并过40目筛。称取10 g荆芥粉，加入300 mL水，加热至60 ℃，保温提取2 h。趁热用6层灭菌纱布过滤、分装入锥形瓶中，冷却至室温，4层食品级保鲜膜及1层食品级保鲜袋密封后，于4 ℃保存备用。按式(1)计算多糖提取率。

(1)

式中：

Y——荆芥多糖的得率，mg/g；

C——荆芥汁中荆芥多糖的浓度，mg/mL；

V1——测定用荆芥汁体积，mL；

V——荆芥汁制备的总体积，mL；

M——荆芥干粉质量，g。

1.2.4 荆芥多糖标准曲线的绘制 参照文献[9]修改如下：用1 mL移液管移取0.1 mg/mL葡萄糖标准溶液各0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7 mL。分别置于10 mL容量瓶中，均添加蒸馏水至1.0 mL，再加入1 mL 50 mg/mL苯酚溶液，然后再加入7 mL浓硫酸，定容，摇匀，放置至室温，同时设置一组空白对照，490 nm处测定其吸光度，绘制标准曲线。

1.2.5 荆芥多糖制备的单因素试验

(1)料液比对荆芥汁制备的影响：在浸提温度60 ℃、浸提时间3 h的条件下，分别按料液比1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50 (g/mL)配置样品，考察料液比对荆芥多糖提取的影响。

(2)提取时间对荆芥汁制备的影响：在浸提温度60 ℃、最佳料液比的条件下，分别在浸提时间1，2，3，4，5 h 时测定多糖含量，以确定最佳的浸提时间。

(3)提取温度对荆芥汁制备的影响：在最佳浸提时间，最佳浸提料液比的条件下，测定浸提温度50，60，70，80，90 ℃下的荆芥多糖提取率以确定最佳提取温度。

1.2.6 荆芥多糖制备的正交优化试验设计 选择提取时间、提取温度、料液比为考察因素，各因素下设3个水平，按L9(34)设计正交试验，以荆芥多糖的提取率作为参考标准，确定荆芥多糖最佳水提条件。

1.2.7 菌种活化及培养 在超净工作台上，用接种环分别挑取青霉菌、酵母菌菌种划线至马铃薯固体培养基上，并置于28 ℃恒温培养箱中倒置培养44～48 h，取出放冰箱冷藏待用。再分别将大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌接种到牛肉膏蛋白胨固体培养基上，置于37 ℃ 恒温培养箱中培养22～24 h，取出放冰箱冷藏待用。

在超净工作台上，分别用接种环在5种菌的斜面培养基上各挑取5环菌，放置于相对应的5瓶250 mL的液体培养基中，混匀，在相应温度下分别培养18～24 h和44～48 h，取出待用。

1.2.8 百合荆梨汁抑菌作用测定 采用滤纸片扩散法[8,16]。将配置好的百合荆梨汁分别以0%，20%，40%，60%，80%，100%加入6支试管中，再将配置好的液体培养基分别以100%，80%，60%，40%，20%，0%依次加入相对应的6支试管中，每支试管均有10 mL，依次做好标记。把滤纸片用打孔器打成直径为5 mm的圆片，制作充足数量，然后灭菌，把灭好菌的滤纸片置于各种抑菌剂溶液中，且每种溶液中的滤纸片为10片，浸泡12 h。无菌水为对照。

将1.2.7制备好的菌悬浮液各取0.2 mL分别均匀涂布于相应培养基的平皿中，制成含菌平板，同时将在各种浓度抑菌剂浸泡好的滤纸片置于含菌平板中，做好标记，同时做3组平行试验。青霉菌和酵母菌菌悬液分别放入28 ℃的恒温培养箱中培养48 h，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌菌悬液放入37 ℃的恒温培养箱中培养24 h。用十字交叉法测定抑菌圈直径。

1.2.9 荆芥汁对百合荆梨汁抑菌作用影响 采用滤纸片扩散法测定抑菌效果。分别取已配置好的100%百合荆梨汁、荆芥汁和百合雪梨汁10 mL放入试管中，把灭好菌的滤纸片置于以上各种液体中，浸泡12 h。无菌水为对照。将1.2.7制备好的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌菌悬液各取0.2 mL分别均匀涂布牛肉膏蛋白胨固体培养基平皿中，每个平板放置浸泡好的滤纸片，37 ℃的恒温培养箱中培养24 h。用十字交叉法测定抑菌圈直径。

1.3 数据处理

在相同的条件下，每组试验重复3次，试验结果用平均值±误差值表示，用SPSS 23进行数据处理，用SigmaPlot 10.0作图。

2 结果与分析

2.1 绘制荆芥多糖的标准曲线

由图1可知，吸光值随葡萄糖含量的增加而增加，二者呈较好的正比例关系。通过统计分析获得葡萄糖标准曲线的回归方程为：Y=7.428 6X+0.098 6，R2=0.976 9。因此，所得标准曲线具有统计学意义，可用于试验中多糖含量的测定。

图1 葡萄糖标准曲线Figure 1 Standard curve of glucose

2.2 荆芥多糖制备工艺优化

2.2.1 单因素试验 由图2(a)可知，荆芥水提法中的料液比对荆芥多糖的提取有明显的影响，随着料液比的增加，荆芥多糖的提取率先上升后下降。当料液比为1∶10 (g/mL)时，提取率仅为(7.22±0.12)mg/g，当料液比为1∶30 (g/mL)时，荆芥多糖的提取率达到最高(27.55±0.41)mg/g，之后随着料液比的增加，荆芥多糖的提取率开始下降，但下降速度较慢。分析原因，可能是料液比大时，由于液体较少，溶出物较多，达到饱和后不再溶出，随着液体的增加，多糖溶出率不断提高。但当料液比过高时，可能由于物料中其他物质的溶出增多，并可能与多糖结合，影响了其原本的特性，使其测定含量微有下降。虽然在不同料液比的提取中，溶出物间不断地相互作用，但在料液比为1∶30 (g/mL)时，可以测得其最大提取率，因此，以1∶30 (g/mL)为最佳料液比。

由图2(b)可知，在提取温度60 ℃、料液比1∶30 (g/mL)的条件下，荆芥多糖的提取率先随提取时间的延长呈先上升后下降的趋势，荆芥水提至2 h时，荆芥多糖提取率最高，为(29.20±0.41)mg/g。1，3 h时，荆芥多糖提取率分别为(25.30±0.36)，(27.90±0.39)mg/g，4 h荆芥多糖提取率继续下降，4，5 h 时下降得很快。以上现象可能是由于随着提取时间的延长，多糖不断溶出，2 h溶出达到最高后，再延长提取时间，多糖结构遭到破坏或降解，从而呈下降趋势[16]。

图2 料液比、浸提时间、浸提温度对荆芥多糖提取率的影响Figure 2 Effects of solid-liquid ratio,extraction time and extraction temperature on the extraction yield of Schizonepeta polysaccharide

由图2(c)可知，在最佳料液比1∶30 (g/mL)、提取时间2 h下，随着提取温度的不断升高，荆芥多糖提取率呈现先上升后下降的趋势。50 ℃时，荆芥多糖提取率为(25.80±0.29)mg/g。60 ℃时，荆芥多糖提取率为(29.35±0.37)mg/g。但提取温度超过60 ℃时，荆芥多糖提取率逐渐下降。80 ℃时，多糖提取率迅速下降，可见荆芥多糖对提取温度比较敏感，提取温度较低时，可以增加植物细胞的通透性，促使多糖尽快溶出；提取温度过高会破坏多糖中的某些化学键，改变其结构，致使得率下降。因此，60 ℃为荆芥多糖提取的最佳温度。

2.2.2 正交试验 根据单因素试验结果，确定正交试验因素水平取值见表1。

由表2可以看出，各因素对水提法提取荆芥多糖提取率的大小影响顺序为料液比>提取时间>提取温度，最佳提取条件为料液比1∶30 (g/mL)，提取温度60 ℃，提取时间2 h。在最优提取条件下，进行荆芥多糖的提取，重复3次，取平均值，最后测得荆芥多糖提取率为(29.43±0.16)mg/g，低于文献[9]报道的荆芥多糖提取率(18.25%)。这可能与试验原料及提取工艺有关。

2.3 荆芥汁对百合荆梨汁的抑菌能力

2.3.1 百合荆梨汁的抑菌能力 选择细菌、霉菌和酵母菌3类菌中的常见5株菌作为试验对象，测定了百合荆梨汁对其的抑菌效果。用十字交叉法测定抑菌圈直径(包括纸片直径)，3次平行试验测量后取平均值，得出结果如表3所示。

表1 荆芥多糖制备的正交试验因素水平Table 1 Levels and factors in orthogonal test of preparation of Schizonepeta polysaccharide

由表3可以看出，随着百合荆梨汁体积分数的增加，对5种菌的抑菌效果均在不断增强。尤其是当百合荆梨汁体积分数为80%时，抑菌效果比较明显，当体积分数达到100%时，抑菌效果更好。表3中还显示，同一体积分数百合荆梨汁溶液对不同菌种的抑菌效果也不同。当体积分数<80%时，同一体积分数的百合荆梨汁对5种菌的抑菌比较差，差别也较小。但当体积分数为80%时，百合荆梨汁仍然对青霉菌、酵母菌抑菌效果较差，但对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果较好。当用100%百合荆梨汁进行抑菌时，百合荆梨汁对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果增加得更多。可见，高体积分数的百合荆梨汁对细菌的抑菌效果较好，对霉菌和酵母菌的抑菌效果较差。

2.3.2 荆芥多糖对百合荆梨汁的抑菌能力的影响 对比图3～图5可以看出，在相应温度下，培养相同时间后，测得的百合荆梨汁、荆芥多糖、百合梨汁细菌都有一定抑制作用，但百合梨汁大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌效果最差，百合荆梨汁的抑菌效果最强。因此可得，荆芥多糖的加入，增强了百合荆梨汁抑制细菌的能力。比较百合荆梨汁和荆芥多糖的抑菌活性发现，百合荆梨汁的抑菌效果还是较强。可见，荆芥多糖和百合梨汁混合后，有增强混合果汁抑菌功效的作用，从而使混合物呈现出高于两种原料的抑菌活性，而不是呈现介于二者之间的抑菌活性。

表2 水提法提取荆芥多糖的正交试验结果Table 2 Orthogonal test results of water extraction of Schizonepeta polysaccharide

图3 百合荆梨汁、百合雪梨汁和荆芥汁对大肠杆菌菌抑菌效果Figure 3 Inhibitory effect of the juice of Lily Schizonepeta Pear juice,Lily Pear juice and Schizonepeta juice on Escherichia coli

图4 百合荆梨汁、百合雪梨汁和荆芥汁对枯草芽孢杆菌抑菌效果Figure 4 Inhibitory effect of the juice of Lily Schizonepeta Pear juice,Lily Pear juice and Schizonepeta juice on Bacillus subtilis

图5 百合荆梨汁、百合雪梨汁和荆芥汁对金黄色葡萄球菌抑菌效果Figure 5 Inhibitory effect of the juice of Lily Schizonepeta Pear juice,Lily Pear juice and Schizonepeta juice on Staphylococcus aureus

3 结论

以荆芥多糖含量提取率为指标，通过单因素正交试验对荆芥汁的制备工艺进行了优化，得出最佳制备工艺参数为：料液比1∶30 (g/mL)，提取温度60 ℃，提取时间2 h。在最优提取条件下，荆芥多糖提取率为(29.43±0.16)mg/g。与其他提取方法比较，此方法简便经济，且制备的提取液用于食品非常安全，可以直接应用到各种食品中。抑菌试验表明，百合荆梨汁对青霉菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都有较好抑制作用，但是对细菌的抑菌效果相对较好。进一步比较分析荆芥汁、百合梨汁和百合荆梨汁的抑菌能力，发现百合荆梨汁抑菌能力最强，荆芥汁的加入大大增强了百合荆梨汁抑菌能力。研究结果显示，荆芥可以应用到饮品中以增强其抑菌活性。后续可以继续对荆芥多糖进行进一步的分离纯化，研究其抑菌机理、抗氧化活性等，为荆芥多糖的深入研究及进一步开发应用提供更多依据。