白苏叶挥发油超临界CO2萃取工艺优化、成分分析及抗氧化活性研究

齐富友 蹇顺华 刘 吟 段丽萍 吴 昭

(1. 武汉黄鹤楼香精香料有限公司，湖北 武汉 430040；2. 武汉黄鹤楼新材料科技开发有限公司，湖北 武汉 430040)

白苏(PerillafrutescensL.Britt.)，唇形科紫苏属植物。现有研究证明，白苏叶具有抑菌、升血糖、保护肠胃、镇静、抗衰老等作用[1-3]，且对动物油脂、肉类和调味食品等具有较强的抗氧化活性[4]。植物挥发油一般是从植物不同部位(种子、根、花、叶、果实、树皮等)加工获得的挥发性物质，也是天然香料的重要组成部分[5]。但挥发油稳定性较差，提取效果易受原料来源、品种、加工方法等影响。传统的提取方法有压榨法、水蒸气蒸馏、溶剂萃取等[6-7]，但存在纯度低、提取效能差、溶剂残留的缺点，现在常用超声、微波、超临界流体萃取等方法[8-9]，其中超临界与超声、微波相比，香气更天然[10]，还可添加夹带剂，萃取的挥发油成分较完整，无残留，无毒、无污染，符合国家大力倡导的绿色发展理念，因此仍是天然植物提取应用的主流方向，尤以食品、挥发油及天然香料的提取分离最为热门[11-12]。

目前，关于白苏叶挥发油的提取多采用水蒸气蒸馏和超声提取，但提取时间长和得率不理想[13]。试验拟以白苏叶为研究原料，通过响应面试验优化超临界CO2萃取白苏叶挥发油提取工艺条件，通过气相色谱—质谱(GC-MS)分析白苏叶挥发油的化学成分，并以DPPH·和·OH的清除能力来评价白苏叶挥发油的抗氧化力，旨在提升白苏叶的实用价值。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

白苏叶：恩施自治州农科院；

硫酸亚铁、水杨酸、30%过氧化氢：AR级，国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 仪器与设备

高速粉碎机：FW-200型，北京中兴伟业仪器有限公司；

超临界CO2萃取装置：HA221-50-06型，江苏南通华安超临界萃取有限公司；

旋转薄膜蒸发仪：HD-205型，瑞士BUCH公司；

气相色谱—质谱联用仪：Agilent GC 6890-MS5973N型，美国Agilent公司。

1.2 方法

1.2.1 白苏叶处理 将白苏叶洗净放入烘箱内，80～90 ℃下干燥24 h，用刀切成段后粉碎，过50目筛得到粒度分布均匀的粉末，备用。

1.2.2 超临界CO2萃取 取处理后的白苏叶250 g，装入萃取罐内，设定萃取压力20 MPa，温度45 ℃，CO2流量30 L/h；其他条件参照文献[14]，按式(1)计算提取率。

(1)

式中：

R——白苏叶挥发油的提取率，%；

m1——白苏叶挥发油的质量，g；

m2——白苏叶原料的质量，g。

1.2.3 水蒸气蒸馏提取 参照文献[15]，称取白苏叶粉末250 g装入烧瓶，倒入1/3体积的蒸馏水和10 mL的萃取剂乙酸乙酯，加热2 h，按式(1)计算提取率。

1.2.4 理化指标测定

(1)色泽：按GB/T 22460—2008执行。

(2)透明度、气滋味：按GB/T 5525—2008执行。

(3)过氧化值：按GB/T 5538—2005执行。

(4)酸值：按GB/T 5530—2005执行。

1.2.5 因素选择 设定萃取压力(25 MPa)、温度(40 ℃)、时间(1.5 h)、CO2流量(25 L/h)为固定值，依次改变萃取压力(15～35 MPa，每个水平增加5 MPa，共5个水平)、萃取温度(30～50 ℃，每个水平增加5 ℃，共5个水平)、萃取时间(0.5～2.5 h，每个水平增加0.5 h，共5个水平)和CO2流量(15～35 L/h，每个水平增加5 L/h，共5个水平)，探讨提取率受各因素的影响程度。

1.2.6 响应面Box-Behnken设计 根据单因素试验结果选定影响较显著的3个因素，设置响应值为白苏叶挥发油提取率，借助Box-Behnken工具进行数据分析，并对模型预测的工艺设置进行重复试验。

1.2.7 白苏叶挥发油的GC-MS分析

(1)色谱条件：色谱柱为DB-5MS毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；进样口温度230 ℃；载气为高纯He；流速l mL/min(恒流)；柱头压83 kPa；进样量1.5 μL；分流比20∶1；程序升温起始温度60 ℃，停留l min，以5 ℃/min的升温速率升至260 ℃保持5 min。

(2)质谱条件：EI离子源；电离能量70 eV；离子源温度190 ℃；传输线温度250 ℃；扫描范围50～550；检索谱库为NIST谱库。

1.2.8 抗氧化活性测定 参照文献[16]。

1.2.9 数据分析 所有试验样品重复3次。运用Excel、Origin 2019b和 Design Expert 8.0.6 软件处理数据。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验

如图1所示，压力上升至25 MPa时提取率显著增加，继续加压提取率反而有所下降，最终压力选择20～30 MPa；温度为40 ℃时提取能力稳定，持续升温不能提高提取率，可能是较高温度会降低挥发油的稳定性，故萃取温度初步定为35～45 ℃；萃取时间在0.5～1.5 h时，挥发油提取率迅速增加，1.5 h后溶液与溶质充分接触达到平衡，继续延长时间提取率也难以提高，所以选用1.5 h左右为提取时间较合适；当CO2流量由25 L/h变为30 L/h时，挥发油提取率显著增加，继续增加挥发油提取率反而下降，在白苏叶挥发油萃取试验中，CO2流量为30 L/h左右最佳。

2.2 响应面试验

2.2.1 响应面试验设计及结果 比较单因素试验结果，最终设置CO2流量30 L/h，选择萃取压力、萃取温度和萃取时间为响应变量(表1)，设定响应值为白苏叶挥发油提取率进行响应面分析(表2)。

对响应面试验数据进行回归分析得各影响因素与响应值的模型回归方程：

图1 萃取压力、萃取温度、萃取时间和CO2流量对白苏叶挥发油提取率的影响Figure 1 Effects of extraction pressure,extraction temperature,extraction time and CO2 flow on the yield of volatile oil from Perilla frutescens leaf

Y=2.45+0.31A-0.26B+0.56C-0.13AB+0.29AC+0.25BC-0.96A2-0.49B2-0.27C2。

(2)

由图2可知，萃取时间一定时，随着萃取压力和萃取温度的升高，响应值Y(白苏叶挥发油提取率)先升高后下降，当萃取压力提升至25 MPa、萃取温度至40 ℃附近时，白苏叶挥发油提取率存在最大值。萃取温度和萃取压力一定时，响应值同样随着其他因素水平的提升先增加后降低。其中萃取压力和萃取时间的影响最显著，响应曲面较陡，与回归模型方差分析结果一致。

表1 响应面试验因素及水平表Table 1 Experiment design of response surface factor

表2 响应面试验设计方案和结果Table 2 The RSM design and results

表3 回归模型方差分析†Table 3 Regression coefficient and variance analysis

图2 各参数交互作用的影响Figure 2 Effects of interaction with different factors

2.2.3 工艺验证 模型预测的最佳工艺组合为：萃取压力26.56 MPa、萃取温度39.76 ℃，萃取时间2.0 h，其预测挥发油提取率约为2.83%。考虑生产应用的可行性，以萃取压力27 MPa、萃取温度40 ℃、萃取时间2.0 h进行验证实验(n=5)。结果表明，白苏叶挥发油提取率为(2.71±1.19)%，与预测值(2.83%)非常接近。相同提取时间下，提取率比水蒸气蒸馏高67%。

2.3 白苏叶挥发油品质分析

2.3.1 萃取工艺对白苏叶挥发油品质的影响 由表4可知，超临界CO2萃取与水蒸气蒸馏相比，挥发油各指标均有一定程度改善，香气更接近天然香味，可能是因为超临界CO2萃取工艺温度低，较好地保留了热敏性物质的天然活性。夹带剂乙醇的加入能一定程度降低过氧化值和酸值，但其机理尚不清楚。

表4 白苏叶挥发油的主要质量指标Table 4 The main quality index of Perilla leaf oil

2.3.2 白苏叶挥发油GC-MS分析 对白苏叶挥发油进行GC-MS分析，其总离子流图如图3所示，共分离出55个峰，并采用面积归一化法计算白苏叶挥发油各组分相对含量，结果见表5。共51种成分被鉴定出，鉴定出的物质成分占总峰的98.49%，其主要成分是酯类、醇类和烯类化合物。在鉴定出的化合物中，相对含量在1%以上的有7种，占被检测物质总量的90.83%，其中乙酸芳樟酯的相对含量达到54.22%，其次是芳樟醇(19.59%)、松油烯(5.06%)、丙酸叶醇酯(4.94%)、β-石竹烯(3.37%)、橙花醇乙酸酯(2.34%)、石竹素(1.31%)等。

图3 白苏叶挥发油的总离子流色谱图Figure 3 Total ion flow chromatography of volatile oil from Perilla frutescens leaf

2.4 白苏叶挥发油的抗氧化活性

2.4.1 清除DPPH·能力 由图4可知，白苏叶挥发油对DPPH·具有很好的清除作用，清除率随浓度的增加而变强，呈明显的量效关系。白苏叶挥发油浓度为60～80 μL/mL时，对DPPH·的清除率变化平缓。相同浓度下白苏叶挥发油对DPPH·清除率低于维生素C。浓度为80 μL/mL时，对DPPH·的清除率为89.21%。

表5 白苏叶挥发油成分的GC-MS分析结果Table 5 GC-MS analysis of volatile oil from Perilla frutescens leaf

2.4.2 清除·OH能力 由图5可知，挥发油浓度为20～60 μL/mL时，随着浓度的升高其对·OH的清除率显著增强；浓度>80 μL/mL时，白苏叶挥发油对·OH清除率与维生素C接近，说明白苏叶挥发油与维生系C的抗氧化活性相当。

图4 白苏叶挥发油对DPPH·的清除率Figure 4 Scavenging rate of volatile oil to DPPH· from Perilla frutescens leaf

图5 白苏叶挥发油对·OH的清除率Figure 5 Scavenging rate of volatile oil to ·OH from Perilla frutescens leaf

3 结论

超临界CO2萃取白苏叶挥发油的最适参数为萃取压力27 MPa、萃取温度40 ℃、萃取时间2.0 h，此条件下白苏叶挥发油实际提取率可达(2.71±1.19)%。与水蒸气蒸馏法对比提取率高67%，且白苏叶挥发油各理化指标均有一定程度改善，香气更接近天然香味，加入夹带剂能一定程度降低挥发油过氧化值和酸值。通过GC-MS分析，白苏叶挥发油中含有51种化学成分，主要是酯类、醇类和烯类化合物。抗氧化试验表明白苏叶挥发油对DPPH·自由基和·OH自由基清除能力与白苏叶挥发油浓度呈正相关，具有一定的抗氧化能力，可作为一种天然抗氧化剂原料。

白苏叶作为一种常见中药和日常调味品，在人们的生活中占据重要地位。但由于白苏叶挥发油的组成成分丰富，其抗氧化机理及清除自由基活性成分分析仍需进一步研究。下一步，拟开展不同夹带剂对挥发油提取率及对品质的影响，并对挥发油中主要的活性成分进一步分离纯化，探讨其体内体外抗氧化机理。