AhHDA1影响花生毛状根生长的研究

曾丽丹， 陈容钦， 李晓云， 李 玲

(华南师范大学生命科学学院∥广东省植物发育生物工程重点实验室， 广州 510631)

研究表明，组蛋白去乙酰化酶能调控植物根系生长[1]. 利用组蛋白去乙酰化酶抑制剂NaB(Sodium Butyrate)处理玉米阻遏根分生组织细胞的有丝分裂，导致玉米根生长受到抑制[1]. 用组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA(Trichostatin A)处理slr-1突变体能够重新诱导侧根形成，说明HDAC抑制侧根形成[2]. 水稻中的组蛋白去乙酰化酶OsHDAC1降低OsNAC6启动子相关部位的乙酰化水平，促进水稻主根生长[3]. 组蛋白去乙酰化酶对根生长具有调控作用，且调控机制与生长素、基因表达和细胞分裂相关.

发根农杆菌诱导产生的毛状根不会产生嵌合体且具有独特性，是比较理想的遗传材料[4-5]. 利用发根农杆菌把外源基因导入植物宿主方法有直接接种法、外植体接种法和原生质体共培养法，其中外植体接种法应用较广，这种方法主要以植物的子叶、下胚轴、幼嫩的茎等部位作为外植体，将其浸泡在活化的发根农杆菌液中，经过共培养、抗性筛选得到无菌毛状根[6]. 本文以花生叶片为外植体，通过外植体接种法获得AhHDA1转基因花生毛状根.

AhHDA1是从花生叶片中克隆得到的组蛋白去乙酰化酶基因，前期研究结果表明该基因转入拟南芥中异源表达后抑制了细胞分裂相关基因AtCYCD1、AtE2Fb和生长素输出相关基因AtPIN1、AtPIN2的表达水平，影响了生长素极性运输,改变生长素在根部的积累和分布，从而影响分生区细胞分裂和伸长区细胞伸长，进而抑制拟南芥主根生长和侧根形成[7]. 本实验将表达载体35S∷eGFP、35S∷AhHDA1-RNAi和35S∷AhHDA1分别转入不同的花生毛状根中获得AhHDA1转基因毛状根，发现3种转基因毛状根侧根生长状况存在差异，故推测AhHDA1影响花生毛状根侧根生长. 本文研究AhHDA1对花生毛状根侧根生长的影响及机制，进一步了解AhHDA1对根系生长的调控作用.

1 材料与方法

1.1 材料培养

选取饱满的花生粤油7号种子浸泡过夜，次日转移至培养皿置于恒温光照培养箱中萌发，萌发期间隔天换1次水. 种子萌发后，播种于盛有泥炭土的圆形花盆中. 培养至二叶期，取叶片作为基因转化的外植体.

1.2 Ri质粒转化花生

分别取带有35S∷eGFP、35S∷AhHDA1-RNAi、35S∷AhHDA1-eGFP载体的K599重组菌进行活化，然后将菌扩大培养至A600达到0.6. 参照苏良辰[8]的方法，对花生叶片进行表面消毒，切断叶脉,在重组菌液中浸泡15 min，叶片转至1/2MS(加头孢霉素和硫酸卡那霉素)培养基上进一步培养获得毛状根.

1.3 RT-PCR检测基因表达

取生长旺盛的花生毛状根(约30天)200 mg，参照Trizol RNA试剂盒(购买自TaKaRa Bio Inc.)说明书提取根部总RNA，采用5X All-In-One RT MasterMix反转录试剂盒[购买自Applied Biological Materials (abm) Inc.]合成cDNA，以cDNA为模板使用Bio-Rad CFX96 Touch荧光定量PCR仪(购买自美国Bio-Rad)检测基因的相对表达量. 扩增程序参照文献[9]，检测所用引物见表1.

1.4 核蛋白提取

取生长至旺盛期的花生毛状根500 mg，参照刘星[10]的方法提取核蛋白.

1.5 蛋白表达检测

提取的核蛋白参照SU等[11]的方法进行SDS-PAGE电泳，通过转膜、孵化、显影等步骤检测不同转基因毛状根中AhHDA1的蛋白表达水平. 一抗为anti-AhHDA1，二抗为兔抗(购至鼎国生物公司).

1.6 启动子活性分析

参照张拜宏[12]的方法获得含以pGreen载体为骨架的pAhIAA28∷LUC和pAhCYCD4∷LUC载体的重组菌. 按质粒小提试剂盒说明书提取质粒. 参考刘星[10]的方法提取拟南芥原生质体，并将质粒转入原生质体，参考Promega Dual-Luciferase报告基因检测系统，收集原生质体并使用多功能酶标仪(购至PerkinElmer)测定(发射峰560 nm)响应载体的原生质体细胞的荧光淬灭值与内参进行比较，计算所得本载体的LUC值.

2 结果

2.1 转基因AhHDA1毛状根中AhHDA1的基因和蛋白表达

利用发根农杆菌将35S∷eGFP(对照，空质粒转化)、35S∷AhHDA1-RNAi和35S∷AhHDA1表达载体导入花生叶片，通过培养获得AhHDA1转基因毛状根. 取出生长旺盛时期的毛状根，鉴定3种转基因毛状根中AhHDA1的表达水平，结果表明：35S∷AhHDA1-RNAi转基因毛状根中AhHDA1的相对表达水平低于对照组，其AhHDA1的转录水平只有对照的60%，而35S∷AhHDA1毛状根中AhHDA1的相对表达水平是对照的77.8倍.

图2结果显示，在35S∷eGFP转基因毛状根中检测不到AhHDA1蛋白表达，而在35S∷AhHDA1毛状根中AhHDA1的蛋白表达水平较高，说明AhHDA1转入毛状根中并正常表达.

图2 35S∷eGFP和35S∷AhHDA1毛状根AhHDA1的蛋白表达水平

2.2 AhHDA1的过表达对花生毛状根的影响

在3种转基因毛状根中，均出现侧根长和侧根短2种不同的表型(图3)，经统计发现，35S∷AhHDA1-RNAi转基因毛状根中侧根长的毛状根所占比例为31.7%(图3A)，高于对照组(17.5%)和35S∷AhHDA1转基因毛状根(18.2%). 在35S∷AhHDA1转基因毛状根中侧根短的毛状根占39.4%(图3B)，高于对照的15.0%和35S∷AhHDA1-RNAi转基因毛状根的2.4%. 说明AhHDA1在花生毛状根中超表达后可能抑制了毛状根侧根生长.

图3 不同表型的毛状根在不同基因型花生毛状根中的百分比

2.3 AhHDA1对毛状根AhCYCD4和AhIAA28的表达及启动子活性的影响

CYCD4编码D型细胞周期蛋白，研究表明CYCD4能够调节细胞的分裂潜能，使中柱细胞转变成中柱起始细胞，从而影响侧根原基形成；IAA28是AUX/IAA基因家族的成员，编码生长素信号转导的早期应答因子. 基因AhCYCD4和AhIAA28在35S∷AhHDA1-RNAi毛状根中的表达水平被显著下调(图4)，而在35S∷AhHDA1毛状根中这2个基因的表达水平皆被显著上调. 说明AhHDA1调控细胞周期相关基因AhCYCD4和生长素信号转导相关基因AhIAA28的表达.

图4 AhHDA1对AhCYCD4和AhIAA28表达水平的调控

分别克隆获得AhCYCD4和AhIAA28启动子上游约2 000 bp的序列，皆含有启动子活性调控、胁迫应答和光合作用相关的功能元件. AhHDA1显著激活AhCYCD4和AhIAA28启动子的转录活性(图5)，说明AhHDA1直接调控基因AhCYCD4和AhIAA28.

图5 AhHDA1对AhCYCD4和AhIAA28启动子活性的调控

2.4 转AhHDA1毛状根中AhARF19和AhIAA28的表达

检测ARF19在转基因毛状根中的相对表达水平，结果所示(图6)，AhIAA28和AhARF19基因在35S∷AhHDA1-RNAi和35S∷AhHDA1毛状根中的相对表达水平不同，其中AhIAA28在35S∷AhHDA1-RNAi毛状根中的表达被抑制，而在35S∷AhHDA1毛状根中的表达水平被上调；而AhARF19在35S∷AhHDA1-RNAi毛状根中表达水平被上调，在35S∷AhHDA1毛状根中表达被抑制，推测AhARF19是AhIAA28的下游基因，AhIAA28可能抑制AhARF19的表达，从而抑制毛状根侧根生长.

图6 AhIAA28和AhARF19在转AhHDA1毛状根中的表达水平

3 讨论

根的发育可塑性对于维持植物的生存和生长来说非常重要[13-14]，根的构型和生长主要与根分生组织的细胞分裂活性相关，与伸长区细胞的长度有关. CYCD4是D型细胞周期蛋白，能够调节细胞的分裂潜能，使中柱细胞转变成中柱起始细胞，从而影响侧根原基形成，拟南芥CYCD4功能缺陷后，中柱细胞分裂速率减弱导致植株的侧根密度减小[15]. 本文的研究结果表明，AhCYCD4在花生的35S∷AhHDA1毛状根中转录水平显著上调，在表型上与对照组相比，35S∷AhHDA1毛状根侧根的生长被抑制，侧根数量没有影响，推测AhCYCD4高水平表达可能诱导中柱细胞分裂，促进35S∷AhHDA1毛状根侧根原基形成，由于侧根原基的分裂、生长过程中可能受到其他因素的影响，使其难以形成侧根.

IAA28是AUX/IAAs家族成员，为生长素信号中的负调控因子，在响应生长素时发生泛素化降解使生长素信号继续传递. 超表达IAA28的拟南芥侧根数量减少，而iaa28突变体植株的侧根数是Col的2～3倍，说明IAA28在侧根的形成过程中起抑制作用[16]. 本文结果显示：超表达AhHDA1的花生毛状根与对照组相比，其侧根的生长被抑制，且AhIAA28在35S∷AhHDA1毛状根中的表达水平显著上调，说明AhIAA28表达上调后可能抑制了毛状根侧根生长，相关文献只提出IAA28抑制侧根形成，没有涉及对侧根生长的影响，我们推测有另一个基因，AhIAA28通过调控这个基因的表达进而调控毛状根侧根生长.

ARFs位于AUX/IAAs的下游，生长素含量较低时AUX/IAAs结合ARFs并抑制其活性. ARFs的B3结构域能够结合生长素应答基因启动子上的生长素响应元件(AuxRE)，从而影响这些基因的转录，在调控侧根发育过程起重要作用[17].arf7arf19双突变体的侧根形成被完全抑制；ARF2、ARF3、ARF4等RNA受干扰后抑制侧根生长[18-20]. 推测AhHDA1调控靶基因AhIAA28的表达水平后，可能影响AhIAA28的下游基因ARFs的表达，进而调控毛状根侧根生长. 检测AhHDA1超表达毛状根中AhARF19的相对表达水平发现，AhHDA1超表达抑制了AhARF19的表达水平，符合超表达AhHDA1抑制花生毛状根侧根生长的表型.AhHDA1在花生毛状根中超表达后显著上调了AhIAA28的表达水平，同时显著抑制了AhARF19的表达，35S∷AhHDA1毛状根的侧根生长受抑制，推测AhARF19很可能是AhIAA28的下游基因. 因此，AhHDA1对花生毛状根侧根生长的调控机制可能是：AhHDA1激活AhCYCD4和AhIAA28启动子的活性，从而上调这2个基因的相对表达水平，AhIAA28表达上调后抑制了其下游基因AhARF19的相对表达水平，从而抑制花生毛状根侧根生长. 关于AhARF19和AhIAA28与毛状根侧根生长之间的关系，两者是否通过生长素AUX/IAA-ARF信号途径作用，需要进一步分析AhHDA1毛状根中AhIAA28的蛋白含量以及AhARF19的蛋白活性.