马齿苋降尿酸及肾脏保护作用的研究

吕有为，潘昱辰，孙铭键，姚 航，王曼力，杜培革，安丽萍

（北华大学药学院，吉林吉林 132000）

高尿酸血症（Hyperuricemia，HUA）是一种常见的代谢性疾病，最常见的病因是尿酸（Uric acid，UA）分泌过多和（或）排泄不足[1]。众所周知，高尿酸血症是痛风的潜在危险因素，也是糖尿病[2]、高血压[3]、动脉粥样硬化[4]和肾脏疾病[5]等多种代谢疾病的危险因素。近年来，由于过量食用富含嘌呤的食物，高尿酸血症和痛风的发病率在全球范围内上升。美国健康与营养调查（NHANES）在2015~2016年进行的研究显示，美国男性和女性高尿酸血症的患病率分别为20.2%和20.0%[6]。据报导，中国大陆高尿酸血症患病率为17.4%[7]。因此，高尿酸血症已成为严重的公共卫生问题，严重影响患者的生活，造成严重的社会经济负担，值得全球关注。临床常用的治疗高尿酸血症的药物多为西药，如果长期服用会导致胃肠道损伤、肝肾损伤等副作用[8]。因此研发安全、有效、副作用小，可长期服用的中药迫在眉睫。

马齿苋（Portulaca oleraeea，PO）别名五行草、长寿菜，是我国101种药食同源的野生植物之一[9]。具有食用和药用双重价值[10]。有相关研究证实马齿苋具有降血糖、抑菌、抗氧化、增强免疫力等多种功能[11]，而对高尿酸血症的研究却未见报道。痛风在中医属“痹症”范畴[12]，本课题在前期工作中拟以筛选清热利湿化瘀的中药，发现了PO的降尿酸作用，因此以PO为研究对象，对PO进行提取及纯化，考察PO的降尿酸作用，进而发掘PO对高尿酸血症的治疗作用，为PO后续研究及成药提供了基础理论以及科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

马齿苋中药饮片 保康中药饮片加工公司；SPF级雄性ICR小鼠 体重20.0±2.0 g，50只，实验动物许可证编号为SCXK（吉）-2016-0003，长春市亿斯实验动物技术有限责任公司；BCA蛋白定量试剂盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、谷胱甘肽过氧化酶（glutathioneperoxidase，GSH-PX）试剂盒 南京建成生物制品研究所；血尿酸（serum uric acid，SUA）、尿尿酸（urine uric acid，UUA）、尿肌酐（urine creatinine，UCr）试剂盒上海酶联生物科技有限公司；次黄嘌呤、氧嗪酸钾、别嘌呤醇 美国Sigma公司；多聚甲醛、苏木素精、硫酸铝钾、伊红、冰醋酸、丽春红G、酸性品红、中性树胶、磷钼酸 上海化学试剂公司；其他化学试剂均为分析纯。

AL204电子天平 梅特勒-托利多有限公司；Milli-Q纯水机 美国Millipore公司；RE-52A旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；THC-20B超声波提取机 济宁天华超声电子仪器有限公司；SHB-B型循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司；UV-2550型紫外可见分光光度计 岛津国际贸易有限公司；GZX-9140ME数显鼓风干燥箱 上海博讯实业有限公司；光学显微镜 日本 Olympus公司；5430R低温高速离心机 美国Eppendorf公司；电热恒温水浴锅 北京长安科学仪器厂；THZ-C恒温振荡器 太仓市实验设备厂；Infinite M200型全波段酶标仪 瑞士Tecan 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 马齿苋提取物的制备 称量5 kg马齿苋干品，粉碎，料液比1:10加入pH=5盐酸溶液，利用超声波提取器，温度50 ℃提取，每次100 min[13]。抽滤，合并提取液，加氨水调pH=8~9，得碱水层石油醚萃取3次，每次30 min。将碱水层石油醚挥干，利用旋转蒸发仪挥去3/4水分，进行干燥，得马齿苋粗提取物，保存备用。

1.2.2 动物饲养条件及高尿酸血症模型的建立 饲养于北华大学动物房清洁笼中。室内温度22±3 ℃，湿度50%±10%。

选取18~22 g健康雄性小鼠50只，随机分为5组：空白组（CON）、高尿酸血症模型组（hyperuricemia，HUA）、别嘌呤醇组（allopurinol，ALLOP，0.02 g/kg/d）、马齿苋高剂量组（PO-H，1.48 g/kg/d）；马齿苋低剂量组（PO-L，0.74 g/kg/d）。给药方式为预防性给药，除CON组和HUA组外，每组按相应剂量连续灌胃给药21 d。从第7 d开始，除CON组外，各组小鼠腹腔注射次黄嘌呤（hypoxanthine，HX，0.3 g/kg/d）和氧嗪酸钾（oxonic acid potassium salt，OAPS，0.3 g/kg/d），CON组注射等量生理盐水[14]。

1.2.3 肾脏指数测定 摘取肾脏。使用0.9%的氯化钠溶液冲洗后用滤纸吸干称重，右侧肾脏投入4%多聚甲醛溶液中固定，左侧肾脏置于−80 ℃冻存备用[15]。

1.2.4 血清SUA、MDA含量测定 末次给药1 h后每只小鼠眼球取血，静置 1 h，离心（4 ℃，3500 r/min，20 min），吸取上层血清用于试剂盒检测血清中SUA、MDA水平。

1.2.5 肝脏XOD、SOD含量测定及肾脏GSH、GSHPX含量测定 称取适量肝脏组织，加入9倍质量分数的生理盐水，冰水中匀浆，制成 10%的匀浆液并离心（4 ℃，3500 r/min，10 min），取上清液，按相关试剂盒说明书检测小鼠肝脏XOD、SOD活性。

取小鼠肾组织适量，加入9倍质量分数的生理盐水，冰水中匀浆，制成10%的肾组织匀浆液并离心（4 ℃，3500 r/min，10 min）。取上清液，按相关试剂盒说明书检测小鼠肾脏GSH、GSH-PX活性。

1.2.6 尿液UUA、UCr含量测定 实验结束前1 d，将小鼠置于代谢笼中，禁食不禁水，收集24 h尿液并记录。将尿液离心（4 ℃，1200 r/min，15 min），取清液按相关试剂盒说明书测定UUA、UCr水平。

1.2.7 肾脏病理学检查 参考HE染色方法[16]，观察小鼠肾脏病理变化。

1.3 数据处理

试验数据采用SPSS17.0软件进行统计学分析，GraphPad Prism5软件进行图表分析。数据均以平均值±标准差（X¯±SD）的形式表示，每组中的样品数目表示“n”。以P<0.05时，表示差异显著；以P<0.01时，表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 对小鼠肾脏指数的影响

脏器的肿大或萎缩体现脏器的损伤情况，脏器与体重的比值减小说明脏器有可能出现一定程度的萎缩，增加说明脏器有可能有增生和水肿的情况[17]。如表1所示。HUA组小鼠肝脏指数、脾脏指数和肾脏指数均极显著（P<0.01）高于CON组，说明腹腔注射HX和OAPS可以引起小鼠的肝脏、脾脏和肾脏肿大，即高尿酸血症模型建立成功。与HUA组比较，PO-H和PO-L组小鼠肾脏指数均极显著（P<0.01）降低，说明马齿苋提取物对HX和OAPS引起的肾脏肿大有一定的抑制作用。但与HUA组比较，给药组的脾脏指数和肝脏指数差异不显著，说明ALLOP与马齿苋提取物对高尿酸小鼠模型肝脏和脾脏指数没有影响。

表1 对小鼠脏器指数的影响Table 1 Effect on organ index of mice

2.2 对小鼠血清SUA、MDA水平的影响

在正常饮食状态下，体内生成尿酸过多或排泄过低，都会引起血尿酸的升高，从而导致高尿酸血症[18]。因此通过在饮食上的调整和使用降低血清尿酸的药物将SUA水平降低至正常值是治疗HUA的主要目标[19]。MDA水平的高低可以反映机体内自由基代谢的情况[20−21]。如图1所示。与CON组比较，HUA组小鼠SUA浓度和MDA水平极显著升高（P<0.01）。说明成功建立了HUA模型。和HUA组比较，PO-H组和PO-L组SUA、MDA水平显著下降（P<0.01或P<0.05）。说明马齿苋提取物可有效降低患病小鼠的SUA水平，且随着剂量的增加，效果增强。

图1 对小鼠血清SUA与MDA水平的影响（n=10）Fig.1 Effects on serum SUA and MDA levels in mice（n=10）

2.3 对小鼠肝脏XOD、SOD及肾脏GSH、GSH-PX水平的影响

XOD是一种与嘌呤代谢有关的酶[22]。XOD在体内水平的升高引起嘌呤分解代谢的增强，最终导致SUA水平升高[23]。 SOD在人体内普遍存在，是一种天然的抗氧化酶，可以保护细胞免受损伤[24]。有研究发现，血尿酸升高是肾脏疾病发生独立危险因素[25]。而GSH-PX可以催化GSH参与过氧化反应，清除生物体内活性氧自由基[26]，提高机体抗氧化能力。如图2所示。与CON组比较，HUA组肝脏XOD水平极显著升高（P<0.01），SOD水平极显著降低（P<0.01）；与HUA组比较，PO-H组肝脏XOD水平极显著降低（P<0.01），SOD水平极显著升高（P<0.01）；PO-L组肝脏XOD水平极显著降低（P<0.01），SOD水平无统计学意义（P>0.05）。由图3所示。与CON组比较，HUA组肾脏GSH、GSH-PX水平极显著降低（P<0.01）；与HUA组比较，PO-H组、PO-L组肝脏GSH、GSH-PX水平均显著升高（P<0.01或P<0.05）。马齿苋提取物可显著降低HUA小鼠血清中XOD、MDA水平，提高SOD、GSH、GSH-PX水平。

图2 对小鼠肝脏XOD与SOD水平的影响（n=10）Fig.2 Effects on XOD and SOD levels in mouse liver（n=10）

图3 对小鼠肾脏GSH与GSH-PX水平的影响（n=10）Fig.3 Effects on GSH and GSH-PX levels in mouse kidney（n=10）

2.4 对小鼠尿液UUA、UCr水平的影响

尿液中Cr的变化可以作为肾脏损害的标志[27]。如图4所示。与CON组比较，HUA组小鼠UUA、UCr水极显著降低（P<0.01）；表明已出现初始肾功能损害。与HUA组比较，PO-H组和PO-L租UCr水平极显著升高（P<0.01），且两组小鼠UUA浓度与HUA组比较无显著性差异（P>0.05）。PO组尿液中Cr水平升高，提示通过马齿苋提取物的治疗，改善了次黄嘌呤和氧嗪酸钾所致的早期肾功能损害。

图4 对小鼠尿液中UUA与UCr水平的影响（n=10）Fig.4 Effects on UUA and UCr levels in urine of mice （n=10）

2.5 肾病理形态学观察

2.5.1 肾组织外观形态 CON组小鼠肾脏的大小正常。颜色为深红色。质地柔软按压时有弹性，表面光滑均匀。HUA组肾脏明显肿大，颜色发白。质地变硬，按压时无弹性。表面粗糙不平，有颗粒感。PO组肾脏外观与CON组接近，肾脏颜色呈淡红色，未见出血点。表面光滑，没有出现变白变硬情况。已知高尿酸血症会加重肾脏疾病的发生，而PO组小鼠肾脏指数相比HUA组有所下降，且双肾外观接近正常组，说明马齿苋提取物延缓了肾脏病变的进程。

2.5.2 光镜下观察肾组织病理表现 在400倍光镜下观察结果如图5所示，CON组小鼠具有清晰完整的细胞结构。细胞间隙正常，没有明显的病理改变。HUA组小鼠肾小球结构紊乱，肾小管明显扩张，且管腔形态排列杂乱不规则。肾间质宽度明显增加，被大量炎症细胞浸润，产生黏液。部分上皮细胞有水肿、坏死的现象。说明HUA组小鼠肾脏有病理性损伤。而当给予马齿苋提取物治疗后，肾小球形态接近正常。肾小管扩张减少，炎性细胞浸润减轻。提示马齿苋提取物可以明显改善HUA小鼠肾脏的病理变化。

图5 肾脏病理形态（400×）Fig.5 Pathomorphology of kidney tissue （400×）

3 结论

本实验研究中，采用HX联合OAPS腹腔注射建立HUA模型，发现马齿苋提取物可有效降低效患病小鼠的SUA水平，且随着剂量的增加，效果增强，但对患病小鼠尿液UUA水平影响较小，其机制可能是通过在体内抑制尿酸的生成，从而起到降低血清尿酸的作用。马齿苋提取物可显著降低HUA小鼠血清中 XOD 、MDA水平，提高SOD、GSH、GSH-PX水平，表明马齿苋提取物可以减少脂质氧化代谢产物的生成，增强机体抗氧化能力。

实验结果表明，马齿苋提取物能够显著降低高尿酸血症小鼠血尿酸水平，其机制可能是通过降低小鼠肝脏XOD活性从而减少尿酸生成。有效延缓小鼠肾脏病变进程。这充分证明了中药在提高机体抗病能力、增强免疫力及毒副作用小等方面的优势，对于马齿苋用于高尿酸血症的治疗提供了参考。