粮食中呕吐毒素的检测能力验证结果分析

◎ 刘天左，戚培培，周 露，王 林，张冰清

（国家有机食品质量监督检验中心（江苏），江苏 扬州 225800）

呕吐毒素，又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol，缩写DON），化学名称3α,7α,15-三羟基-12,13-环氧单端孢霉-9-蒽-8-酮，属单端孢霉稀族化合物。呕吐毒素是镰刀菌属的菌种引起的谷物赤霉病的重要指示性毒素，因其可引起猪的呕吐而得名呕吐毒素[1-2]。呕吐毒素的污染状况与产生毒素的毒株、温度、湿度、通风以及日照等因素有关。呕吐毒素属于剧毒或中等毒物，当人摄入了被呕吐毒素污染的食物后，可能会导致呕吐、腹泻、头疼以及头晕等以消化系统和神经系统为主的中毒症状，严重时损害造血系统造成死亡，其慢性毒性对胃癌细胞、免疫系统有一定影响，且有明显胚胎毒性和一定致畸作用。由于中国传统饮食习惯中粮谷比例大大高于西方，使得呕吐毒素的危害尤为突出。1998年，在国际癌症研究机构公布的评价报告中，呕吐毒素被列为3类致癌物[3]。因此，对呕吐毒素的检测关系到粮食、食品、饲料多个领域的安全问题。

目前，我国现行国家标准《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》（GB 2761—2017）规定谷物及其制品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的限量为1 000 μg·kg-1，《饲料卫生标准》（GB 13078—2017）规定植物性饲料原料中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的限量为5 mg·kg-1。目前，呕吐毒素的常见的检测方法有薄层色谱法（TLC）、高效液相色谱法（HPLC）、柱净化法结合电子捕获检测器的气相色谱法（GC/ECD）、高效液相色谱串联质谱法（HPLC-MS/MS）、放射性免疫测定法（RIA）以及酶联免疫吸附筛查法（ELISA）等[4]。而此次能力验证本实验采用的方法是免疫亲和层析净化高效液相色谱法。

能力验证是指利用实验室间比对，按照预先制定的计划来评价参加者的一项外部质量控制活动。参加能力验证不仅能够确认实验室自身的技术能力，还能通过与外部实验室的横向比对，发现实验室自身存在的问题并加以整改，以进一步提升检测能力[5]。本次实验室参加的能力验证计划由国家市场监督管理总局组织，大连海关技术中心负责协调及实施。参加本次能力验证目的是了解和评价本实验室对粮食及食品中呕吐毒素含量检测的能力和水平，促进和提升本实验室检测粮食及食品中呕吐毒素的技术能力和水平，规范实验室管理。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米粉，4份：由大连海关技术中心提供的能力验证样品，计划编号CNCA-21-03，样品编号分别为39906、54202、03311、17610，其中39906号和54202号用于检验能力评估，03311号和17610号为干扰样品。质控样品：玉米粉中呕吐毒素含量检测质控样品（1.4±0.4）mg·kg-1，k=2，大连海关技术中心。

甲醇，色谱级，上海安谱实验科技股份有限公司；聚乙二醇（相对分子质量为8 000；阿拉丁）；玻璃纤维滤纸（WHATMAN）；呕吐毒素免疫亲和柱（ROMER DON StarTM)；磷酸盐缓冲溶液（以下简称PBS）：称取8.00 g氯化钠、1.20 g磷酸氢二钠、0.20 g磷酸二氢钾、0.20 g氯化钾，用900 mL水溶解，调pH=7.0，用水定容到1 000 mL；标准溶液标准品：呕吐毒素（1ST7213-100A-S070305，First Standand）。

1.2 仪器与设备

液相色谱仪配二极管阵列检查器（Agilent 1200，美国安捷伦）；C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm，上海安谱实验科技股份有限公司）；混合圆周振荡器（KS-60，德国IKA）；高速离心机（BIOFUGE STRATOS，Thermo Fisher）。

1.3 实验方法

1.3.1 检测方法

按照《食品安全国家标准 食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定》（GB 5009.111—2016）第二法免疫亲和层析净化高效液相色谱法[6]，并参照作业指导书要求。

1.3.2 标准溶液配制

吸取1 mL呕吐毒素标准品（100 μg·mL-1）于10 mL容量瓶中，用甲醇-水（20∶80，V/V）定容为10 μg·mL-1的标准物质使用液，吸取标准物质使用液0.1 mL、0.4 mL、1 mL、2 mL、5 mL分别到10 mL容量瓶中用甲醇 -水（20∶ 80，V/V）定容，得到 0.1 μg·mL-1、0.4 μg·mL-1、1 μg·mL-1、2 μg·mL-1、5 μg·mL-1标准系列溶液。

1.3.3 色谱条件

色谱柱：C18，4.6 mm×150 mm，5 μm；柱温：35 ℃；流动相：甲醇-水（20∶80，V/V）；流速：1 mL·min-1；进样量：50 μL；检测器：二极管阵列检测器（DAD）；检测波长：218 nm。

1.3.4 样品提取

称取25 g左右玉米粉样品于100 mL具塞三角瓶中，加入5 g聚乙二醇，加100 mL水，混匀，混合圆周振荡器振荡20 min，以玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，收集滤液于干净的离心管中，10 000 r·min-1离心5 min。

1.3.5 样品净化

事先将低温下保存的免疫亲和柱恢复至室温，待免疫亲和柱内原有液体流尽后，准确移取上述滤液2.0 mL于免疫亲和柱中。调节下滴速度，控制样液以每秒1滴的流速通过免疫亲和柱，直至空气进入亲和柱中。用5 mL PBS缓冲盐溶液和5 mL水先后淋洗免疫亲和柱，流速约为每秒1～2滴，直至空气进入亲和柱中，弃去全部流出液，抽干小柱。准确加入2 mL甲醇洗脱亲和柱，控制每秒1滴的下滴速度，收集全部洗脱液至试管中，在50 ℃下用氮气缓缓地将洗脱液吹至近干，加入1.0 mL甲醇-水（20∶80，V/V）溶液，涡旋30 s溶解残留物，0.45 μm滤膜过滤，收集滤液于进样瓶中以备进样。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

根据预试验选择浓度线性范围为0.1～5 μg·mL-1，将呕吐毒素标准系列溶液按照浓度由低到高依次注入液相色谱仪，以目标物呕吐毒素的浓度（μg·mL-1）为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。浓度与峰面积呈现良好的线性关系，线性方程为y=53.764 68x+1.073 46，相关系数为0.999 92。标准曲线见图1。

图1 呕吐毒素标准曲线图

2.2 质控样品测定

为验证方法的可靠性，称取玉米粉质控样按照上述实验条件测定玉米粉质控样品中呕吐毒素的含量。质控样品平行进样2次，测定结果见表1。检测结果在质控范围内，满足实验要求。

表1 质控样品测定结果表

2.3 能力验证结果

测试结果以μg·kg-1为单位上报，保留到小数点后一位，每份样品重复测定两次，取平均值。样品编号分别为 39906、54202、03311、17610，其中 39906号和54202号用于检验能力评估，03311号和17610号为干扰样品，呕吐毒素能力验证报告也给出了干扰样品的Z值参考。

能力验证结果见表2。能力验证评定原则为|Z|小于3时，参加机构的结果合格，因此根据呕吐毒素能力验证结果报告给出的本实验室结果的Z值，本次能力验证结果为合格。

表2 呕吐毒素能力验证结果表

3 结论与讨论

对能力验证结果影响的因素有很多，实验前应充分考虑到人、机、料、法、环及测各个环节对测定结果的影响，安排经验丰富的实验人员进行试验，本次呕吐毒素测定时要注意以下几方面。

（1）收到样品后应该避光密封保存，开封后，应该旋紧封盖，并置于密封袋中，防止样品被污染。

（2）标准物质在定量分析中有至关重要的作用，本次实验室参加能力验证使用了有证标准物质，纯度符合要求定量时测试样品浓度落在标准曲线范围内。

（3）呕吐毒素样品前处理过程中主要有两个方面对结果影响较大，一方面是提取过程，振荡或超声的时间一定要够，如果可以的话，上均质机均值会更好；另一方面是免疫亲和柱的选择，本次实验采用的是ROMER的DONStarTM免疫亲和柱，柱容量高达2 500 ng，因此能完全适用本次能力验证，如果使用柱容量较小的免疫亲和柱，会使测试的结果偏低。

（4）为保证测定结果的准确性，本次能力验证，实验室在操作中采用了同时带质控样品的形式进行质量控制。

（5）呕吐毒素有较强的毒性并且是3类致癌物，因此实验人员在操作时必须进行必要的个人防护，同时妥善处理好试验后的废弃物，以防二次污染。