不同条件对过硫酸氢钾复合粉杀菌效果的影响研究

刘伯承，王 慧，刘俊琦，杜丽飞，刘彬扬，杨 俊※

（1.湖南省畜牧兽医研究所，湖南长沙410131；2.湖南省长沙市芙蓉区大同第三小学，湖南长沙410125）

发展和壮大生态健康养殖是我国农业现代化建设的重要基础。近年来，随着农业产业结构不断深入改革和完善，区域化、集中化、规模化成为当前养殖发展的新形式，同时生物安全法也在新的形式下即将落地，给养殖业带来了新的机遇与挑战。要建立健全绿色生态健康养殖模式，打造无疫区生态养殖，做好消毒灭源是其关键抓手。过硫酸氢钾复合物是由过硫酸氢钾（KHSO5）、硫酸氢钾（KHSO4）和硫酸钾（K2SO4）组成的固体物质[1]，通过破坏细菌细胞壁蛋白及其通透性发挥杀菌作用，具有活性高、稳定、无毒副作用等优点[2]。目前，在兽药中作为一种广谱、高效、安全杀毒剂被广泛应用[3]。然而，养殖生产实践中环境因素复杂，加上基础人员对不同消毒剂特点认识不到位，导致盲用、滥用的现象，因此，应根据不同的环境和使用目的来合理选择使用消毒剂，使其提高杀菌效率。本研究以奶牛乳房炎源金黄色葡萄球菌为受试株，通过悬菌液定量杀灭试验研究了不同梯度浓度，不同时间及温度作用下过硫酸氢钾复合粉的杀灭效率，以期为防控奶牛乳房炎及养殖生产中消毒剂的使用提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要仪器及试剂

洁净工作台，购自力康精密科技（上海）有限公司；水浴恒温摇床，购自常州国宇仪器制造有限公司；漩涡混合器，购自常州越新仪器制造有限公司；血琼脂培养基，购自贝瑞特生物科技有限公司；LB肉汤培养基，购自杭州百思生物科技有限公司；胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）购自青岛海博生物科技有限公司；过硫酸氢钾复合粉，购自佛山市某制药有限公司，批号：兽药字190373276，含有效氯不少于10%；硫代硫酸钠，购自上海迈瑞尔化学技术有限公司；PBS缓冲液，购自长沙市博仪生物科技有限公司。

1.2 受试菌株

金色葡萄球菌为湖南省畜牧兽医研究所兽医兽药实验室经鉴定保存的菌株。

1.3 实验方法

1.3.1 悬菌液和消毒液的制备

悬菌液的制备：无菌挑取单个菌落置5mL LB肉汤的试管中，水浴恒温培养14h后做细菌菌落计数，用灭菌水调整菌落数浓度至1×107～5×107CUF/mL4℃保存备用。

磷酸盐缓冲液（PBS）的配制：取10g PBS缓冲液（干粉），溶于800 mL去离子水中，定容至1000 mL，调整pH 7.2～7.4，121℃高压蒸汽灭菌后4℃保存备用。

中和剂的配制：取硫代硫酸钠1200 mg加入400 mL PBS中，121℃高压蒸汽灭菌后4℃保备用。

消毒剂的配制：临用前取1g过硫酸氢钾复合粉置400mL PBS稀释液中。

1.3.2 中和剂鉴定试验

以上述调整好的悬菌液为受试菌液，参照2002年版《消毒技术规范》[4]消毒剂杀微生物试验中和剂鉴定试验规定进行操作及结果判定。设a、b、c、d、e、f共6组，a组：消毒剂＋菌悬液，用于验证消毒剂的杀菌效果；b组：（消毒剂＋菌悬液）＋中和剂，用于验证消毒剂在杀灭细菌后能否被完全中和；c组：中和剂＋菌悬液，用于验证中和剂对细菌的生长是否有抑制作用；d组：（消毒剂＋中和剂）＋菌悬液，用于验证中和产物对细菌的生长是否有抑制作用；e组：稀释液＋菌悬液，为阳性照组；f组：稀释液＋中和剂，为阴性对照组。

具体操作：取0.5 mL调整好的悬菌液加入至4.5 mL消毒剂（2.5 mg/L）的试管中，室温下作用5 min；取0.5 mL混合液加入至4.5 mL中和剂（3 g/L硫代硫酸钠）的试管中，作用10 min；c、d、e组做1000倍稀释，取100 μL涂布到STA平板上（做两个平行板），37℃培养18～24 h，每个试验重复3次，计算细菌菌落数，结果取平均值。

1.3.3 不同温度和作用时间下悬菌液定量杀灭试验

试验设A组（1min）、B组（5min）、C组（10min）、D组（阳性对照）、E组（阴性对照）。每组分别在4℃、20℃、30℃环境温度下取0.5mL浓度为1×107～5×107CUF/mL悬菌液加入至含4.5mL的消毒液（KHSO4）试管中，作用规定时间后取0.5mL混合液加入至4.5mL中和剂中，作用10 min后取100μL至STA平皿涂板，37℃培养20 h，同时设置以PBS替代消毒液为阳性对照组，以同批STA平板为阴性对照；每组试验重复3次，取其平均值。

2 结果

2.1 中和剂鉴定试验

根据2002年版《消毒技术规范》中和剂判断标准，从表1可以看出，a组无菌生长，b组菌落数明显减少，c、d、e组菌落数比较接近，误差率＜15%，f组无菌落生长。说明硫代硫酸钠对过硫酸氢钾复合粉有较好的中和效果，符合本实验要求。

2.2 不同温度和作用时间下悬菌液定量杀灭试验

3种不同浓度（1:400、1:800、1:1600）过硫酸氢钾复合粉在5 min和4℃、20℃、30℃作用条下对金色葡萄球菌的杀灭达100%，而在1 min和4℃条件作用下分别为98.6%、95.5%、92%；1 min时间作用下，同一浓度的杀灭率随着温度的上升有所提高，说明时间对杀灭效果的影响较明显，温度从4℃升高至30℃有利于杀灭效果（见表2）。

表2 过硫酸氢钾复合粉对金黄色葡萄菌的杀灭率

3 讨论

目前，畜禽业常用的化学消毒剂主要有卤素类（氯制剂、溴制剂、碘制剂）、氧化剂类、酸碱类、酚类、醛类、表面活性剂、醇类等[5]。各种消毒剂因其特点发挥不同的消毒效果，因此合理使用消毒剂对疫病防控及消毒灭源至关重要。同时，鉴于传统消毒剂在一些安全性和抗性方面的缺点，新一代低毒高效适用广泛复合消毒剂的研发受到关注，过硫酸氢钾复合粉作为新一代高效安全消毒剂的代表，在畜禽养殖业被广泛使用。

研究结果发现3种不同浓度过硫酸氢钾复合粉在5 min和4℃、20℃、30℃作用条下对金色葡萄球菌的杀灭达100%，说明时间对悬菌液的作用影响显著。在不同浓度组，温度从4℃升高至30℃时过硫酸氢钾复合粉对金黄色葡萄球菌杀灭效率均有提高，且在低浓度组中杀灭率的提高比高浓度组更为明显，与王娟等[6]研究结果相近；在生产实践中消毒剂对不同菌属杀灭效果也有差异，刘元元等[7]研究发现在畜禽舍现场表面过硫酸氢钾复合粉对革兰氏阴性菌的杀灭效果明显优于革兰氏阳性菌，且在1∶400浓度下作用10min对金色葡萄球菌的杀灭率为89.73%。

过硫酸氢钾复合粉对病毒类微生物也表现出较好杀灭效果，我国在非洲猪瘟发生后，过硫酸氢钾复合粉成为猪场防控消毒的常用消毒剂。杨瑞梅等[8]在研究猪场非洲猪瘟消毒中发现，过硫酸氢钾复合粉消毒后舍内环境细菌数从300 cuf/m2降至50 cuf/m2，ASFV（非洲猪瘟病毒）荧光定量检测全部为阴性。杀菌作用明显；张交儿等[9]研究发现，浓度为1000 mg/L的过硫酸氢钾复合粉溶液作用5 min，可有效灭活悬液内ASFV；在秦涛等[10-11]对4种消毒剂对H5N6亚型流感病毒、H7N9亚型流感病毒的杀灭效果研究中，过硫酸氢钾复合物在推荐使用量下对H5N6、H7N9亚型流感病毒无杀灭作用，需使用0.2%（W/V）溶液作用10 min才有杀灭效果，但相比其他成分消毒剂依然表现出了浓度低、作用时间短的优势。

大量研究证明，过硫酸氢钾复合物活性好、稳定、低毒、使用方便，可用于各种环境、器具、进出场人员及舍内带猪消毒，但现场使用中建议根据不同环境和季节调整浓度和作用时间，可提高对病原微生物的有效杀灭率。