海藻酸钠对O-羧甲基壳聚糖/阿拉伯胶复凝聚反应的影响

周颖，滕静，李晓丹，刘亮，肖军霞

（青岛农业大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266109）

复凝聚反应是指两种带相反电荷的生物大分子通过静电吸引相互作用产生沉淀的一种自发现象[1-2]，目前在食品领域研究最多的复凝聚体系是多糖/蛋白质体系和多糖/多糖体系，已报道的有黄原胶/壳聚糖[3]、阿拉伯胶/壳聚糖（gum arabic/chitosan，GA/CTS）[4]、海藻酸钠（sodium alginate，SAL）/壳聚糖[5-6]和 O-羧甲基壳聚糖（O-carboxymethyl chitosan，O-CMC）/GA等。王津等[7]分别对GA/CTS和GA/O-CMC复凝聚体系包埋5-氟尿嘧啶和杀虫剂啶虫脒的最佳工艺、微胶囊稳定性和芯材释放性能进行了初步研究。Espinosa-Andrews等[8]对GA/CTS复凝聚体系在食品领域的应用进行了较为系统的研究，确定了复凝聚相中两种大分子的组成对复凝聚反应的影响，并对复凝聚相的表面结构和流变学性质进行了系统研究。孙燕婷等[9]确定了GA和CTS复凝聚反应的最佳工艺，在一定条件下制备的GA/CTS复凝聚相具有较好的肠道靶向释放性能，可以作为水包油型乳液的微囊化壁材。但目前尚未见到SAL对O-CMC/GA复凝聚反应及复凝聚相性质影响的研究。

本研究主要探讨添加SAL对O-CMC/GA复凝聚反应及复凝聚相性质的影响，同时采用差示扫描量热仪（differential scanning calorimetry，DSC）、扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）和动态流变仪等手段对制备的复凝聚相进行表征，以确定添加SAL对复凝聚相功能性质的影响。本研究对于开发新型功能的多糖/多糖复凝聚体系具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

CTS（脱乙酰度 95.2%、黏度 500 mPa·s、食品级）：潍坊海之源有限公司；SAL（CP）、GA（食品级）、氢氧化钠（AR）：上海国药集团化学试剂有限公司；氯乙酸（AR）：天津巴斯夫有限公司；盐酸、无水乙醇、异丙醇（AR）：莱阳市康德化工有限公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器

UV-2000紫外可见分光光度计：上海尤尼科仪器有限公司；Mar-90恒温磁力搅拌器：上海亚荣生化仪器厂；SPS401F万分之一分析天平：赛多利斯科学仪器有限公司；DL-5-B低速大容量离心机：上海安亭仪器设备厂；ZDG-0.25真空冷冻干燥机：烟台冰轮股份有限公司；NicoletIR200傅里叶变换红外光谱仪：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；200PC差示扫描量热仪：德国耐施仪器公司；JSM-7500F扫描电子显微镜：日本电子株式会社；Delta320 pH计：瑞士梅特勒托利多公司；MCR102动态流变仪：奥地利安东帕有限公司。

1.3 方法

1.3.1 复凝聚相的制备

根据Chen等[10]的方法制备O-CMC，通过滴定法确定其取代度为0.35。称取不同质量比的GA和SAL，将其分别溶于去离子水中定容至100 mL，然后等体积混合搅拌均匀，制成不同浓度的GA-SAL溶液，置于4℃冰箱中保存待用。将一定浓度的O-CMC溶液与GA-SAL溶液混合，调节pH值，于特定温度下反应1h，4 000r/min离心20 min得到O-CMC/GA-SAL复凝聚相。

1.3.2 复凝聚反应的检测

1.3.2.1 浊度

复凝聚反应结束后，将反应液倒入1 cm的比色皿中，迅速在600 nm处测定吸光度，以去离子水作为对照。

1.3.2.2 复凝聚相产率

待复凝聚反应完成后，4 000 r/min离心20 min，收集复凝聚相，于50℃下干燥至恒重，按下式计算复凝聚相产率。

1.3.3 复凝聚反应条件的优化

1.3.3.1 pH值对O-CMC/GA-SAL复凝聚反应的影响

将1%的O-CMC溶液与5%的GA-SAL溶液（其中GA与SAL的质量比为99∶1）等体积混合，使混合液的总固形物浓度达到3%。用0.1 mol/L的NaOH或HCl溶液分别调节混合液的pH值至2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 和 6.5，25 ℃下反应 1 h，测定反应体系的浊度和复凝聚相产率。

1.3.3.2 温度对O-CMC/GA-SAL复凝聚反应的影响

将1%的O-CMC溶液与5%的GA-SAL溶液（其中GA与SAL的质量比为99∶1）等体积混合，使混合液的总固形物浓度达到3%。用0.1 mol/L的NaOH或HCl溶液分别调节混合液的pH值至3.0，分别置于4、25、35、45、55 ℃下反应 1 h，测定反应体系的浊度和复凝聚相产率。

1.3.3.3 O-CMC与GA-SAL质量比对两者复凝聚反应的影响

将1%的O-CMC溶液分别与1.0%、2.0%、3.0%、4.0%和5.0%的GA-SAL混合溶液（其中GA与SAL的质量比为99∶1）等体积混合，此时O-CMC与GA-SAL质量比分别为 1∶1、1∶2、1∶3、1∶4 和 1∶5。用 0.1 mol/L 的NaOH或HCl溶液调节溶液的pH值至3.0，25℃下反应1 h，测定反应体系的浊度和复凝聚相产率。

1.3.3.4 SAL含量对O-CMC/GA-SAL复凝聚反应的影响

将一定量的SAL与GA分别溶于去离子水后混合使其总浓度达到4%，GA与SAL的质量比分别为99∶1、74∶1、49∶1 和 24∶1。将上述 GA-SAL 溶液与 1%O-CMC溶液等体积混合，使混合液总固形物浓度达到2.5%。用0.1 mol/L的NaOH或HCl溶液调节溶液的pH值至3.0，25℃下反应1 h，测定反应体系的浊度和复凝聚相产率。

1.3.4 复凝聚相的表征

将1%的O-CMC溶液与4%的GA-SAL混合溶液（其中GA与SAL的质量比为74∶1）等体积混合。采用0.1 mol/L的NaOH或HCl溶液分别调节混合液的pH值至 3.0、4.5、6.0，25℃下反应 1 h，4 000 r/min 离心20 min，收集复凝聚相进行表征。

1.3.4.1 DSC分析

对 O-CMC、GA、SAL及 O-CMC/GA-SAL 复凝聚相冻干粉进行DSC分析。取5 mg样品，分别加入到DSC样品盒中，以空白盒为参照，试样在氮气保护下，以5℃/min的速率从30℃加热到300℃，通过计算机记录加热过程中的差热曲线。

1.3.4.2 SEM分析

对O-CMC/GA-SAL复凝聚相冻干样品进行SEM分析。扫描电镜样品制备方法：在样品台上贴一层双面胶，分别将不同条件下的复凝聚相放置于样品台上，然后在样品上喷金供SEM观察，电压为2kV。

1.3.4.3 流变学特性

对O-CMC/GA-SAL复凝聚相的流变学性质进行研究。将样品置于校正好的动态流变仪平台上，在（30±0.2）℃下，用锥板（1°）对样品在黏弹性范围内进行频率扫描和触变测试，板间距离d=0.1 mm。

1.4 统计分析

每个试验重复3次，结果以平均值±标准差形式表示。采用SPSS统计软件（SPSS Statistics 17.0.1）进行t检验和方差分析，当p＜0.05时差异显著。

2 结果与分析

2.1 复凝聚反应条件的优化

2.1.1 pH值对O-CMC/GA-SAL复凝聚反应的影响

pH值会影响聚电解质之间的电荷平衡，是影响复凝聚反应的一个重要因素。pH值对O-CMC/GA-SAL复凝聚反应的影响见图1。

图1 pH值对O-CMC/GA-SAL复凝聚反应的影响Fig.1 Effect of pH on the complex coacervation of O-CMC/GASAL

由图1可知，pH值对O-CMC与GA-SAL之间的复凝聚反应有重要影响。复凝聚相产率随着pH值的增加呈先升高后降低的趋势，在pH值为3.0时达到最大值57.30%，说明在此pH值下O-CMC与GA-SAL的复凝聚反应程度最大。这一结果及变化规律与OCMC/GA复凝聚反应体系一致，即在pH3.0时两者之间的复凝聚反应最强[11]，反应体系中添加一定量的SAL对O-CMC/GA的最适复凝聚反应pH值没有影响。由图1可知，反应体系的浊度在pH5.0达到最大值，但在pH3.0较小，这与复凝聚相产率的结果不一致。这可能是由于在pH3.0时复凝聚反应非常充分，所形成的复凝聚相聚焦程度高、粒径大，导致它们在短时间内发生复凝聚反应并沉淀，从而使测得的上清浊度偏低。另外，从图1还可以看出，O-CMC、GA及SAL在试验所选择的浓度下于600 nm下均无光吸收，因此在随后的研究中均不再测定这3种聚电解质的吸光度。

2.1.2 温度对O-CMC/GA-SAL复凝聚反应的影响

除了静电吸引之外，聚电解质之间的氢键和疏水性相互作用在复凝聚相的形成中也起着重要作用。高温有利于疏水性相互作用，而低温则可以促进氢键相互作用[12]。温度对O-CMC/GA-SAL复凝聚反应的影响见图2。

图2 温度对O-CMC/GA-SAL复凝聚反应的影响Fig.2 Effect of temperature on the complex coacervation of O-CMC/GA-SAL

由图2可知，温度对O-CMC/GA-SAL之间的复凝聚反应有重要影响，4℃下复凝聚相的产率最高，为63.2%；此后随着反应温度的升高，复凝聚相产率随之下降。反应体系的浊度则在25℃时最高，此后随着反应温度的降低或升高均呈现降低的趋势。结果表明低温有利于O-CMC/GA-SAL复凝聚反应的发生，说明氢键可能在复凝聚相的形成中起到了重要作用。由于25℃时产率仅比4℃下低5.8%，且25℃下进行复凝聚反应简单易行，因此选择25℃为复凝聚反应温度进行后续研究。

2.1.3 O-CMC与GA-SAL质量比对两者复凝聚反应的影响

聚电解质之间的配比对于溶液中的静电平衡有重要影响，因此就pH3.0下O-CMC与GA-SAL质量比对两者复凝聚反应的影响进行研究，结果见图3。

图3 O-CMC/GA-SAL质量比对两者复凝聚反应的影响Fig.3 Effect of biopolymer ratio on the complex coacervation of O-CMC/GA-SAL

由图3可知，O-CMC/GA-SAL质量比对两者的复凝聚反应有重要影响，过大或过小均不利于复凝聚反应的发生。随着两者混合比例的增加，复凝聚相产率呈现出先增加后降低的趋势，当两者质量比为1∶4时复凝聚产率最大，达到了71.8%；而反应体系的浊度在两者质量比为1∶2时达到最大，在1∶4时较小，其原因可能为当O-CMC与GA-SAL质量比为1∶3和1∶4时，反应体系复凝聚相的聚集程度最大，迅速形成沉淀，导致测定的浊度降低；当两者的混合比例随之增加或降低时，由于复凝聚相聚集程度降低，大部分复合物呈悬浮状态，虽然复凝聚相的产率有所降低，但是测得的浊度仍然较高。当两者的质量比为1∶1时，由于复凝聚相产率过低，两者的相互作用程度较弱，形成的复凝聚相较少，导致浊度最低。因此选择O-CMC与GA-SAL质量比为1∶4进行后续试验。

2.1.4 SAL含量对O-CMC/GA-SAL复凝聚反应的影响

GA-SAL复合物中SAL含量对复凝聚反应的影响见图4。

图4 SAL含量对O-CMC/GA-SAL复凝聚反应的影响Fig.4 Effect of SAL content on the complex coacervation of O-CMC/GA-SAL

由图4可知，随着GA-SAL复合物中SAL所占比例的降低，复凝聚相产率呈现先降低后增加的趋势且在质量比为74∶1时达到最大；当质量比为99∶1时复凝聚相产率不再显著变化。这是由于复凝聚反应的最适pH值为3.0，该pH值低于SAL中古罗糖醛酸和甘露糖醛酸的解离常数（3.20和3.38）[13]，因此SAL携带的负电荷含量较少甚至不带电荷而无法参与复凝聚反应，导致复凝聚相产率随着SAL含量的增加而降低。添加不同量SAL时所得复凝聚相的浊度无显著性差异。当GA与SAL复合物的质量为99∶1时，复凝聚相产率最高为70.4%。考虑到GA与SAL质量比为99∶1和74∶1时复凝聚相产率的差异不显著，采用质量比74∶1进行后续研究。

2.2 复凝聚相的表征

2.2.1 DSC分析

O-CMC/GA-SAL复凝聚相的DSC分析结果如图5所示。

图5 不同pH值下制备的O-CMC/GA-SAL复凝聚相的DSC图谱Fig.5 DSC patterns of O-CMC/GA-SAL complex coacervates separated in different pH

由图5可知，所有的O-CMC/GA-SAL复凝聚相均出现了两个吸热峰和一个放热峰。第一个吸热峰可归因于水分的蒸发，第二个吸热峰是由于破坏基团之间的静电相互作用和复凝聚相的网络结构需要吸收能量引起的[14-15]，而放热峰是由于O-CMC分解所致[16]。

O-CMC/GA-SAL复凝聚相峰值温度见表1。

表1 O-CMC/GA-SAL复凝聚相峰值温度Table 1 Peak temperatures of O-CMC/GA-SAL coacervats in DSC thermogram

由表1可知，O-CMC/GA-SAL复凝聚相第一吸热峰温度随着pH值增大而降低，这可能是由于复凝聚相在制备过程中，随着pH值的升高，羧基和水分子的氢键作用力随之降低，使得第一吸热峰温度随着pH值增加而降低。O-CMC、GA、SAL均没有出现第二吸热峰，但是三者发生复凝聚反应后在220℃左右均出现了吸热峰，该吸热峰是由于静电相互作用被破坏所致，因此DSC分析证实了三者之间发生了复凝聚反应。pH6.0时所得复凝聚相的放热峰温度（276.96℃）明显高于其它两个pH值，说明O-CMC/GA-SAL复凝聚相的热稳定性随着pH值的增加而提高。

2.2.2 SEM分析

当SAL含量占聚阴离子总量的1/75时，在pH3.0、4.5、6.0条件下制备所得O-CMC/GA-SAL复凝聚相的微观结构分别如图6所示。

图6 在pH3.0、pH4.5和pH6.0下制备的O-CMC/GA-SAL复凝聚相的扫描电镜图Fig.6 SEM micrographs of O-CMC/GA-SAL coacervates separated in pH3.0，pH4.5 and pH6.0

由图6可知，在3个pH值下制备的O-CMC/GASAL复凝聚相均具有明显的多孔网络结构，且随着复凝聚反应pH值的上升，O-CMC/GA-SAL复凝聚相网络结构的致密度有所增加，且孔穴的孔径逐渐减小。通过与未添加SAL的O-CMC/GA复凝聚相相比[17]，添加SAL后复凝聚相的网络结构更加规则，孔径分布更加均匀，说明此时的复凝聚相更适合用于敏感成分的包埋。

2.2.3 流变学特性

2.2.3.1 O-CMC/GA-SAL复凝聚相的触变特性

O-CMC/GA-SAL复凝聚相的触变特性见图7。

图7 在pH3.0、pH4.5和pH6.0下制备的O-CMC/GA-SAL复凝聚相的触变特性Fig.7 Thixotropic properties of O-CMC/GA-SAL coacervates prepared at pH3.0，pH4.5 and pH6.0

由图7可知，在不同pH值条件下制备的O-CMC/GA-SAL复凝聚相均为假塑性流体[18]，即随着剪切速率的增加，黏度迅速降低，说明复凝聚相具有剪切变稀特性；当剪切应力撤销时，复凝聚相的结构重新排列，下行线始终低于上行线，黏度仅部分恢复[19]。说明复凝聚相在受到外力时，复凝聚相的空间网络结构重新排列，形成了新结构，并且新结构的稳定性低于之前的结构。

反应pH值对复凝聚相的触变特性具有一定影响。pH4.5和pH6.0下制备的O-CMC/GA-SAL复凝聚相的起始黏度明显大于pH3.0下制备的复凝聚相，这可能是由于O-CMC和GA之间的复凝聚反应逐渐增强所致。当pH4.5及pH6.0条件下所得的复凝聚相的黏度在剪切力逐渐降低时均极低，在剪切力的作用下其结构被破坏，当外力撤销时无法恢复到初始黏度。

2.2.3.2 O-CMC/GA-SAL复凝聚相的黏弹性

在不同pH值下制备的O-CMC/GA-SAL复凝聚相的黏弹特性见图8。

图8 在pH3.0、pH4.5和pH6.0下制备的O-CMC/GA-SAL复凝聚相的黏弹特性Fig.8 Viscoelastic properties of O-CMC/GA-SAL coacervates separated in pH3.0，pH4.5 and pH6.0

由图8可知，O-CMC/GA-SAL复凝聚相在剪切频率逐渐增加的过程中储能模量始终大于损失模量，表现出类似固体弹性行为[20]。不同pH值下形成的复凝聚相黏弹性有所差异。在剪切频率增加过程中，在pH4.5和pH6.0下制备的O-CMC/GA-SAL复凝聚相的储能模量和损失模量明显大于pH3.0下制备的复凝聚相。这表明可以通过调节反应的pH值来获得具有特定黏弹性的O-CMC/GA-SAL复凝聚相。

3 结论

通过探讨SAL对O-CMC/GA复凝聚反应及复凝聚相性质的影响，以确定添加SAL对复凝聚相功能性质的影响。结果表明，与O-CMC/GA体系相比，添加SAL对其最适反应条件无显著影响，即最适反应条件为pH3.0、O-CMC与GA-SAL质量比1∶4、反应温度25℃、反应时间1 h。SAL的含量对O-CMC/GA-SAL复凝聚相的微观结构有一定影响，随着SAL含量的增加，复凝聚相的网络结构更加致密；含SAL的O-CMC/GA复凝聚相均为假塑性流体，且主要表现出固体弹性性质，这对于开发多糖/多糖复凝聚体系新功能具有重要意义。