油茶高产与低产无性系代谢表达谱标记鉴别

曹汉洋，何祯祥，李志真，卢世明，郑登耿，陈耀升，赖标祯

(1.福建省沙县水南国有林场，福建 沙县 365500； 2.南京大学生命科学学院，江苏 南京 210046；3.福建省林业科学研究院，福建 福州 350012； 4.福州植物园，福建 福州 350012)

油茶(CamelliaoleiferaL.)是我国重要木本油料树种，也是世界四大木本油料树种之一，主要分布于我国南方省区[1]。其产品茶油是高级食用油，脂肪酸组成与橄榄油相似，长期食用十分有利于人体健康。油茶种植于山上，不与粮食争地，为山区林农提供大量的劳动就业机会。油茶产业是我国特色优势产业，发展油茶产业既可以保障国家粮油安全，改善国民健康，又能促进林农增收致富，助力山区脱贫，乡村振兴，经济、生态和社会效益兼得，符合国家可持续发展战略需求，具有重要的现实意义和广阔的推广应用前景[2]。常规的油茶良种选育要经过优树选择—无性系测定—无性系区域试验等程序，历时十几年，不能满足生产实际对油茶高产优质良种的迫切需求。

大量研究表明油茶无性系之间的产量差异极大，高产与低产之间差异巨大。目前，影响油茶产业快速发展的关键之一就是油茶高产优质品种的选育与应用。如何科学、准确、快速选择高产无性系是摆在林木遗传育种学家面前的重要科学问题。木本植物产量性状是受多基因控制，而且与环境的影响也特别大，因此，单纯从常规育种来选育高产油茶品种存在周期长等问题。国外新近的研究结果表明，通过各种现代分析技术如GC-MS，LC-MS，1H-NMR等，能够获得大量靶向或非靶向代谢表达谱[3-4]。目前，该技术在农作物小麦、玉米[5-6]以及杨树、花旗松、麻栎等林木上[7-9]得到广泛应用，但未见在油茶上应用的报道。生物标记的成功开发可用于准确筛选和预测高产的优良无性系，将对林木育种计划产生重要影响。本研究拟采用GC-MS技术，通过油茶高产与低产品种组代谢表达谱标记识别技术，从代谢表达谱的角度建立一套用于区分低产与高产油茶品种的方法，以期为油茶新品种选育提供参考。

1 试验地概况

试验点位于沙县水南国有林场(117°46′E、26°21′N)，海拔240 m。年均气温15.6～19.6 ℃，年降水量1510～2000 mm，土壤为红壤。试验地进行清杂，开水平带整地，带宽1.5～2 m，穴规格60 cm×50 cm×40 cm，株行距(1.8～2.2)m×(2.5～3)m，种植密度约1500株·hm-2，油茶无性系评比试验林于2011年春完成上山定植。造林后对试验林进行抚育管理，每年除草抚育2次，上半年和下半年各1次，施肥1～2次，春季施复合肥100～350 g·株-1，随着林龄增加，冬季隔年施有机肥1 kg·株-1。冬季进行适度修剪，剪除病虫枝、过密枝、徒长枝等。

2 材料与方法

2.1 供试材料

在福建省沙县水南国有林场的油茶无性系评比试验林中选择3株高产油茶树，编号为A、B、C，2017—2019年单株平均产果量依次为2.62、2.35、1.5 kg，构建高产组；选择3株低产油茶品种，编号为D、E、F，2017—2019年单株平均产果量依次为0.49、0.46、0.01 kg，构建低产组。

2.2 试验方法

2020年5月12日在高产组和低产组每个单株上的上、中、下部位分别采集5个嫩芽，先按每株混合，然后每组进行混合。高产组和低产组各取新鲜混合样品100 g，用无水甲醇1000 mL浸泡3 d，倾出溶剂并收集，重复3次，把3次所得溶液全部合并，然后减压蒸干溶剂，高产组得深褐色膏状物31.5 g，低产组得深褐色膏状物30.8 g。将所得2组深褐色膏状物分别用甲醇稀释至1 mL，得到2组代谢物溶液。将2组代谢物溶液稀释至0.05 mg·L-1进行GC-MS上机分析，GC条件为进样量：2.00 μL；DB-5弹性石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25μm)；气化温度280 ℃；程序升温：初始温度60 ℃，保留1 min，然后以10 ℃·min-1升至280 ℃，保留3 min；载气为氦气，分流比10∶1，载气流速0.8 mL·min-1；峰面积归一化法计算各化合物相对含量；紫外检测器条件：波长254 nm；带宽16 nm；稀释因子：1.0000。MS条件为离子源：EI，电子能量70 eV；MS离子源温度：230 ℃；MS四极杆温度：150 ℃；采集模式：全扫描，扫描范围20～650 amu；检索谱库：NIST谱库；得到高产组和低产组代谢表达谱。将获得的高产组和低产组代谢表达谱按相对含量进行排序，选择具有含量显著性差异的化合物。

3 结果与分析

3.1 油茶高产组和低产组代谢表达谱

根据GC-MS数据分析结果获得的油茶高产组、低产组代谢表达谱见表1、表2。从表1、表2种看出，高产组共获得34种代谢产物，低产组共获得28种代谢产物。

3.2 与产量相关的代谢表达谱标记

根据油茶高产组和低产组代谢表达谱，按相对含量(>1%)得到差异表达标记(表3、表4)。高产组角鲨烯(保留时间17.718 min)的相对含量为4.07%，低产组角鲨烯(保留时间17.232 min)的相对含量为35.87%，显著高于高产组(P<0.001)；保留时间17.227 min的化合物A在高产组中相对含量为31.85%，而在低产组中未检测到。显然，这2个代谢产物可作为潜在的油茶高产与低产无性系代谢表达谱标记。

表1 油茶高产组样本代谢表达谱

表2 油茶低产组样本代谢表达谱

表2(续)

表3 油茶高产组和低产组样本代谢表达谱标记

4 讨论

油茶产量与茶油品质除受自身遗传特性影响外，还受到外界环境影响，这给油茶的高产品种选育带来极大的困难。在优良品种的选育上，大多限于单一指标的评价，研究者多限于从结实量、含油率、抗性等单一性状考虑，往往缺乏对影响油茶产量和品质的因素进行综合评价。因此，研究遗传特征和生物学特征等方面与油茶产量和品质的关系可为优质高产油茶选育提供参考。

植物在生长发育过程中，其花芽分化阶段的代谢物对植物发育的调控起着重要作用，在林木上有一些研究观测到代谢物与产量的相互关系[9]。因此，植物代谢表达谱可能为育种和繁殖提供有用的筛选工具。目前，代谢表达谱标记在林木上应用还比较少。查到唯一发表的文献是来自韩国的科学家Jun Won Kang等(2018)在Quercusacutissima无性系种子园中所作的研究[9]，发现高产无性系叶片中的蔗糖和肌醇的含量显著高于低产无性系(P<0.05)；此外，高产无性系叶片中磷酸、琥珀酸、苹果酸，茎中丁烷-1，3-二醇含量也高于低产无性系。本研究对3个高产和3个低产油茶无性系构建高产和低产BULK样本组，进行花芽分化期间嫩芽中的代谢物差异分析，结果在油茶中首次发现角鲨烯和化合物A与油茶产量具有显著相关性，角鲨烯的相对含量高产组为4.07%，低产组为35.87%，低产组显著高于高产组(P<0.01)；保留时间为17.227 min的化合物A在高产组中相对含量为31.85%，而在低产组中没有检测到。虽然现在还无法确定这2个化合物与待测无性系的产量水平相关，但是作为一种新的选择方法，对今后油茶无性系选育具有一定的参考价值。

Jun Won Kang等[9]在Quercusacutissima无性系种子园中除了对花芽分化期间的幼叶代谢物进行分析，另外还对植物体内的内源激素(IAA、ABA、(9G)Z、(7G)iP、iP、(9R)DZ、BA和cis-Z)水平进行测定。结果发现，(9G)Z的激素含量与林木生长、冠幅以及球果数量呈显著负相关。对于油茶代谢表达谱的相关研究，除不同发育阶段的代谢表达谱外，今后还应对植物内源激素水平进行测定，以期在不同类型的代谢表达谱中发现更多与茶油产量性状的标记，用于高产新品种的选育。