基于网络药理学麻黄治疗小儿遗尿机制探讨

唐有男，吴 涛，范 鹏，陈积豪，吴红彦

（广东省深圳市罗湖区中医院，广东 罗湖 518000）

小儿遗尿症（Infantile Enuresis，IE）是指5岁以上儿童，每周2次以上，不能从睡眠中醒来无意识地排尿，连续3个月以上[1-2]。据权威统计[3]在全球5岁儿童中大约有16%的儿童患有该病，在11～12岁儿童中大约有5%的儿童患有该病。中国医师协会在2020年的调查中发现IE患病率大约为4.8%，而由于年龄、性别、农村、城市等的差异，许多患儿同时还存在一定的心理问题[4]。长期得不到有效的治疗就会致其忧郁、性格内向，而焦虑、注意力不集中，学习和生活受到严重影响[5]。西医对该病的治疗主要以基础、报警器、药物等疗法为主[6]，但临床疗效欠佳，且复发率高，更有甚者报道有副作用[7-8]。中药以多成分、多靶点、多通路的独特优势[9]。有研究表明麻黄治疗小儿遗尿临床疗效显著[10]。

麻黄，性味辛，微苦，温，归肺和膀胱经，最早见于《神农本草经》，记载其功效为:“主中风，伤寒头痛，温疟，发表汗，去邪热气，止咳逆上气，除寒热，破积聚”[11]。具有发汗解表、宣肺平喘、利水消肿等功效[12]。现代药理研究麻黄碱在治疗小儿遗尿疗效显著，可能增强了膀胱三角肌及膀胱括约肌的张力，减少膀胱储藏的尿量[13]。本研究运用网络药理学方法，通过对中药麻黄多成分、多靶点与小儿遗尿生物系统网络进行探究[14]，进一步探究麻黄防治 小儿遗尿的潜在机制并揭示其科学内涵，为药理研究和临床运用提供理论支撑。

1 方法

1.1 活性成分筛选

中药药理学数据库（TCMSP）[15]（http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php），将口服生物利用度OB≥30%，类似度（DL）≥0.18设定为筛选条件[16]进行药物化合物的筛选。

1.2 活性成分靶点的获取

运用蛋白质数据库（UniProt）[17]（http：//www.uniprot.org/），将“human”设置为限定物种，利用Perl软件校正靶点名称。

1.3 疾病相关靶点基因获取

以“小儿遗尿”为关键词，在OMIM（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/omim），GeneCards[18]（https://www.genecards.org/）获取小儿遗尿的基因靶点，运用R软件前，安装Venny包，将麻黄主要有效活性成分、靶点和小儿遗尿基因靶点，获得该药与IE的交集靶点，即为药物治疗IE的核心靶点。

1.4 药物-靶点-小儿遗尿网络图的构建

将麻黄治疗小儿遗尿的关键靶点上传到Cytoscape[19]（http：//www.cytoscape.org），构建“药物-靶点-小儿遗尿”PPI图。网络图构建并呈现药物-靶点-小儿遗尿之间的联系，进一步探究麻黄治疗小儿遗尿的作用机制。通过中心度、节点度值进一步挖掘核心麻黄治疗小儿遗尿的节点。

1.5 构建PPI（Protein-ProteinInteraction）

将治疗的核心靶点输入STRING[20]数据库（https：//string-db.org）中，将筛选物种设定为“Homo Sapiens”，将Mediumconfidence设定大于0.4，获取蛋白靶点信息，构建PPI图，以txt文件保存。运用Cytoscape中的Network Analyzer 插件进行拓扑学分析，包括度值、介度值、中心度值分析，获取核心靶点。

1.6 GO注释及KEGG通路分析

运用R语言，将筛选条件P＜0.05，进行GO、KEGG富集分析，同时对结果可视化处理。

2 结果

2.1 活性成分筛选

运用TCMSP查找药物主要有效活性成分，设定OB≥30%和DL≥0.18 为主要有效活性成分的筛选条件，获得潜在有效活性成分15个，见表1。

表1 麻黄活性成分表

2.2 麻黄治疗小儿遗尿的潜在作用靶点

获得药物主要有效成分为15个。在GeneCards、OMIM库中共搜索小儿遗尿相关靶点，运用R语言安装“VennDiagram”包，将药物核心靶点和疾病靶点取交集，获得麻黄有效活性成分治疗小儿遗尿的关键靶点，得到韦恩图（图1）。获得靶点27个，揭示了麻黄可能是调控多个靶点发挥治疗小儿遗尿的作用。

图1 麻黄有效成分作用靶点及小儿遗尿靶点交集

2.3 药物-靶点-小儿遗尿网络图

通过Cytoscape对药物治疗小儿遗尿的靶点网络绘制和统计。揭示了药物主要活性成分与疾病关键靶点的关系（图2）。中心度、度值揭示了节点在PPI图中核心度的高低，度值越高，说明该节点在图中的作用越显著。研究按Degree值和BC值大小排序筛选核心成分和靶点，结果显示，山柰酚、槲皮素、木犀草素、β谷甾醇、豆甾醇、芫花素等麻黄有效成分是网络图的核心节点，这些核心节点是麻黄治疗小儿遗尿的主要靶点，见表2。

图2 麻黄治疗小儿遗尿网络图

表2 麻黄治疗小儿遗尿拓扑学特征

2.4 麻黄治疗小儿遗尿的关键靶点

使用在线平台STRING，导入麻黄治疗小儿遗尿的靶点，设定筛选条件P＞0.9，将游离蛋白隐藏，获得PPI图（图3）。该图节点共27个，边171条，平均值12.7。图中的“节点”代表麻黄靶点，“边”表示核心靶点的相互作用。边数越多表示该节点对应的靶点在网络中的作用越显著。运用R语言绘制信息条形图（图4）。结果ESR1、IL6、EGFR、AR、CASP3、CCND1等蛋白的度值较高，说明这些蛋白在网络中的作用显著，是和其他蛋白互通的纽带。

图3 关键靶点PPI网络

图4 关键靶点信息条形图

2.5 GO生物功能及KEGG通路分析

进一步阐明靶点的可能性对靶点进行GO、KEGG分析。GO揭示麻黄治疗小儿遗尿的关键靶点前5个生物学功能主要为DNA结合转录因子结合（8个靶点），核受体活性（5个靶点），配体激活转录因子活性（5个靶点），RNA聚合酶II特异性DNA结合转录因子结合（6个靶点），ATP酶结合（5个靶点）等,表明麻黄主要有效活性成分可以通过调控多种途径而发挥治疗小儿遗尿的作用（图5）。运用KEGG富集分析，获取31条信号通路图，将P值＜0.01为筛选条件，得到17条通路。设置P值和相关基因的数量为筛选条件，获取前4条通路进行相关分析，结果见图6。分析发现，基因显著富集在AGE/RAGE（6个位点基因）、HIF-1（5个位点基因）、Estrogen（8个位点基因）、Thyroid（5个位点基因）等信号通路上。

图5 关键靶点注释信息图

图6 KEGG富集分析图

3 讨论

本次研究出麻黄主要活性成分15个，获得27个治疗靶点，绘制成“成分-靶点-疾病”网络图，麻黄主要有效活性成分为山柰酚、槲皮素、木犀草素、β谷甾醇、豆甾醇、芫花素等药物活性成分。获得ESR1、IL6、EGFR、AR、CASP3、CCND1蛋白，GO富集分析结果证实，麻黄治疗小儿遗尿的基因功能主要体现在RNA聚合酶II特异性DNA结合转录因子结合，DNA结合转录因子结合，配体激活转录因子活性，核受体活性，ATP酶结合等过程，KEGG 富集分析，共获得31条通路，其中主要为4条通路，分别为AGE/RAGE、HIF-1、Estrogen、Thyroid等，因此，推测麻黄中的主要活性成分是通过上述通路基因来达到治疗小儿遗尿的目的的。

网络药理学作为探究麻黄治疗小儿遗尿的一种新方法，同时也遵循了中医的整体观。从整体观的角度去探究麻黄与小儿遗尿之间的关联性，揭示麻黄是一种多成分、多途径、多通路的协同作用，通过调控不同的靶标、不同的通路，发挥治疗作用。借助该方法，探讨了麻黄治疗小儿遗尿的作用机制，同时也揭示了麻黄治疗小儿遗尿多维调控网络，为麻黄治疗小儿遗尿的药物研究提供了依据，为实验和临床的研究提供了新的思路。