HJD 与NIC 联合黏菌素对耐药肺炎克雷伯菌的体外抑菌作用研究

韩荣嘉，梁梦菊，翟亚军，刘建华，彭祖焜，闫峰宾，吴 华

（河南农业大学 动物医学院，河南 郑州 450046）

当前畜牧业养殖中肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae， KPN）是仅次于大肠杆菌的第二大条件性致病菌［1］，能造成严重的感染和较大的经济损失［2］，兽医临床中耐药性肺炎克雷伯菌的报道也越来越多［3］，且部分地区已有对黏菌素耐药的肺炎克雷伯菌感染报道，增加了其感染治疗的难度和复杂性。黏菌素（Colistin， COL）是有效治疗革兰氏阴性菌多肽类抗生素药物，因其独特的抗菌作用机制而被用于多重耐药菌的感染防治。但自2015年我国兽医临床首次报道COL耐药以来［4］，对COL耐药的兽医临床菌株报道也日益增多，这限制了COL的使用。而研发抗菌辅助药物来降低菌株对COL的耐受力、增加COL的敏感性是当前抗多重耐药肺炎克雷伯菌感染的主要措施之一，如与中药组方、中药单体、增效佐剂联用等。

中药方剂黄连解毒汤（Huanglian Jiedu Decoction， HJD）由黄连、黄芩、黄柏、栀子组成，具有抑菌、抗炎、抑制肿瘤、抗氧化且对肠道菌群具有一定的促进作用［5］。近年来，中西药联用的研究不断增加，复方剂黄连解毒汤与多种抗生素联用表现出的明显抑菌作用值得深入研究。氯硝柳胺（Niclosamide， NIC）常作为肠道驱绦虫药，近年来有研究表明［6-7］：NIC与COL联用时能增强耐COL革兰氏阴性菌的敏感性，多次证明可以有效恢复碳青霉烯类、COL类抗生素的抗菌活性，具有逆转多重耐药革兰氏阴性菌（包括COL耐药的肺炎克雷伯菌）的潜力。

过度使用抗菌药物及耐药机制的横向传播，导致同时对多种抗微生物药物耐药的多重耐药菌（Multi-drug resistant， MDR）越来越多。COL耐药肺炎克雷伯菌属于多重耐药菌（MDR-KP），其临床治疗困难，需用新型抗菌药物或新的联合抗菌理论予以治疗。而中药与佐剂联合是当前逆转COL耐药的主要用药策略之一。本研究将HJD与NIC联合应用，探寻了有效的抗菌佐剂来降低肺炎克雷伯菌对COL的耐药性，或恢复COL抗革兰氏阴性菌的敏感性，以期找到合适的中药联合增效佐剂及逆转耐药佐剂，用于人医和兽医临床应用，也为创新联合用药措施提供一些新的研究思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验菌株 依据2019版CLSI的折点［8］（MIC值≥4 μg/mL）判断耐药菌株，本试验选用3株耐COL的肺炎克雷伯菌KP1（猪场废水分离）、KP4（猪场废水分离）和KP9（人医临床分离），1株敏感菌株KP28（人医临床分离）。

1.1.2 主要试剂、培养基及药品 试剂：去离子水、蒸馏水、无水乙醇、1 mol/L氢氧化钠溶液；营养培养基：LB培养基、MH（B）培养基、麦康凯琼脂；药品：5120 μg/mL硫酸黏菌素（76.6%）、1 g/mL黄连解毒汤、5120 μg/mL氯硝柳胺（98%）；均购自天驰生物公司。

1.1.3 主要仪器 电热恒温生化培养箱（由赛默飞世尔科技有限公司生产）；无菌超净工作台（由苏州安泰技术有限公司生产）；高压蒸汽灭菌锅（由上海生光仪器厂生产）；电子分析天平（由上海菁海仪器有限公司生产）；电热恒温鼓风干燥箱（由上海益恒试验仪器有限公司生产）；空气摇床（由北京六一仪器厂生产）；移液枪、台式低速离心机（由德国Eppendorf公司生产）；电磁炉（由美的集团有限公司生产）等。

1.2 试验方法

1.2.1 HJD（1 g/mL）的制备 将黄连、黄芩、黄柏、栀子按照3∶2∶2∶3的比例合计称取50 g于一定量的蒸馏水中，浸泡30 min，大火煮沸之后转文火，煮至体积少于200 mL，经2层无菌纱布过滤后，滤渣再用500 mL蒸馏水用同样方法，煎制一段时间后合并煎液。文火煮至50 mL，浓度即为1 g/mL。无菌药用注射器取上清液，经0.45 μm滤膜过滤于2 mL EP管，置于-20 ℃冰箱中保存。

1.2.2 单药MIC值的测定 采用微量肉汤稀释法［9］测定单药MIC值。在无菌超净工作台上，用移液枪吸取5 μL的培养好的菌液，加入装有5 mL MHB肉汤的EP管中，用漩涡混匀仪混匀。测定COL、NIC单药MIC值时采用10倍稀释法。在每一行第1孔加入含12 μL的药液和108 μL菌液的120 μL体系，之后每孔加入60 μL菌液，倍比稀释至倒数第2孔。HJD采用双倍稀释方法，吸取50 μL的药液加入反应板每一行的第1孔，再往第1孔加入50 μL的菌液，之后每孔加入50 μL的菌液，倍比稀释至倒数第2孔。密封放置于恒温保温箱，培养18 h后读取结果。

1.2.3 两药联合MIC值的测定 根据试验设计，设定需固定浓度的药物梯度或者亚抑菌浓度，将药物和MHB肉汤配制成固定浓度的体系，即5 mL药物和MHB混合液，再向该体系中加入培养好的5 μL菌液，在漩涡混匀仪上混匀。按照COL单药药敏的方法倍比稀释至倒数第2孔，最后一孔作为阳性对照，密封放置于恒温保温箱，培养18 h后读取结果。

1.2.4 用棋盘法测定部分抑菌浓度指数（FIC） 将2种药物分别在2块96孔无菌反应板按照10倍稀释或双倍稀释的方法，进行12×12的棋盘法单药倍比稀释，然后将2块反应板的对应孔混合均匀，并作阳性对照。密封放置于恒温箱，培养18 h后读取结果。

1.2.5 三药联合测定MIC值 将1 μg/mL NIC固定到MHB中，再将不同浓度的中药固定到MHB中，配制成5 mL体系的不同浓度中药、NIC与MHB的混合液。然后按照COL单药微量肉汤稀释法进行倍比稀释，最后一孔作为阳性对照。密封放置于恒温保温箱，培养18 h后读取结果。

2 结果与分析

2.1 单药MIC值的测定结果

单药MIC值的测定结果见表1，COL对KP1、KP4和KP9的单药MIC值均为128 μg/mL，对KP28的单药MIC值为0.5 μg/mL；NIC对4株菌的MIC值＞512 μg/mL；黄连解毒汤对4株菌的MIC值均为250 mg/mL。

表1 3种药物对肺炎克雷伯菌的单药MIC值

2.2 两药联合MIC值的测定结果

2.2.1 NIC与COL联合的抑菌作用 本研究选用0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、16.00 μg/mL 共7个浓度的NIC与COL联合用药，结果见表2。当NIC浓度在1~16 μg/mL之间时，与COL联用效果较明显；对于耐药菌株KP1、KP4、KP9，8 μg/mL NIC与COL联用时的效果最佳，分别能使COL的MIC值下降至原来的1/16410、1/512和1/4096；而对于敏感菌株KP28，联用后COL的MIC值最低下降至原来的1/128。

表2 不同浓度NIC联用COL的MIC值

2.2.2 HJD与COL联合的抑菌作用 根据HJD对试验菌株的MIC值，将HJD浓度固定为1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC，分别与COL联用并测定其MIC值，结果如表3所示。1/2 MIC （125000 μg/mL） HJD是与COL联用的最佳浓度，最低能使其MIC值下降至原来的1/512；对于敏感菌株KP28,能使其MIC值下降至原来的1/8。

表3 不同浓度HJD联合COL的MIC值

2.3 用棋盘法测定两药联合的FIC指数

根据棋盘法试验要求［9］， FIC指数= MIC（A组联合） /MIC（A组单药） +MIC（B组联合） /MIC（B组单药）。其中， FIC≤0.5为协同作用、0.5＜FIC≤1为加性作用、1＜FIC≤2为无关作用、FIC＞2为拮抗作用。两药联合的 FIC指数结果见表4。对于NIC与COL联合的 FIC值，3株耐COL菌株的FIC＜0.5，两药表现为协同作用。就HJD和COL联合的FIC值而言，菌株KP1的FIC＜0.5，两药表现为协同作用，KP4和KP9的 FIC值均为0.625，两药表现为加性作用。

表4 用棋盘法测定两药联合的FIC指数

2.4 三药联合结果

选取1 μg/mL作为NIC的固定浓度，将NIC、COL分别与1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC这3个浓度的HJD联合，测定试验菌株三药联合的MIC值，分析和判断1 μg/mL NIC与HJD是否有协同作用。结果见表5，亚抑菌浓度的HJD加NIC与COL联用后对菌株的MIC值均大于1 μg/mL NIC联用COL对菌株的MIC值，初步判定HJD和NIC没有协同增效作用，其联合作用效果有待深入研究和进一步验证。

表5 1 μg/mL NIC和亚浓度的HJD联用COL的MIC值

3 讨论

静止期杀菌剂COL具有独特的作用机制，曾作为治疗革兰氏阴性菌包括多重耐药菌的优势抗生素，但其耐药性的不断出现限制了其在临床的应用，为其找到有效的增效佐剂或逆转耐药佐剂成了近几年研究热点［10-12］。

Domalaon等［7］的研究表明：NIC与COL联用对肺炎克雷伯菌的抑菌效果具有协同作用，1 μg/mL NIC与COL的联合效果最佳。而本试验研究表明：8 μg/mL NIC与COL联用的效果最佳，菌株个体差异性及菌株样本数较少可能是导致该结果的主要因素。研究表明，NIC能逆转产碳青霉烯酶和（或）耐COL肠杆菌科细菌对COL的耐药性且具有协同作用［13］。本研究进一步证实了NIC在耐药肺炎克雷伯菌菌株中的增效作用。

HJD作为中国经典中药组方，具有价格低廉、易获得、疗效确定、作用广泛、药效持久等特点，在人医和兽医临床上均已得到了广泛的应用。高桂玲等［14］研究指出，HJD可用于难治性支原体肺炎的治疗。覃伟等［15］在2021年报道中认为HJD联合阿奇霉素治疗肛周脓肿的效果明显。侯欣颖等［16］验证了长期使用高剂量的HJD有类抗生素的作用，在临床治疗细菌感染方面具有很大的潜力。此外，HJD在联合用药方面，对革兰氏阳性菌也有很好的抑制作用，例如周芳芳等［17］在2019年的报道中认为HJD联合左氧氟沙星、庆大霉素后对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的抑菌效果显著增强。本研究再次证实了HJD联合COL对COL耐药肺炎克雷伯菌具有体外抑菌增效作用，具备作为兽医临床联合COL用药较大的应用潜力。

曾雪花等［18］研究表明，HJD对铜绿假单胞菌和大肠杆菌的MIC值＞1000 mg/mL，而本研究结果表明：HJD对肺炎克雷伯菌的MIC值为250 mg/mL，说明HJD对不同革兰氏阴性菌的抑菌效果存在差异。HJD与COL联用能使耐药菌株对COL的MIC值下降至原来的1/512，且FIC值在0.312~0.625之间，有协同和加性作用。HJD组方中黄连的主要成分小檗碱、黄芩提取物黄芩均已被证实了具有逆转耐COL大肠杆菌及沙门氏菌的作用［19-20］。本研究也证实了HJD组方具备增效或逆转COL耐药的潜力，但组方中药物成分多样复杂，发挥抑菌作用的成分可能不止一种，其是否具备更优异的增效作用、与中药单体存在哪些增效差异、具备什么样的作用机制等需要进一步深入研究。

当COL与NIC、HJD三药同时联用时，COL的MIC值并没有在两药联合的基础上进一步下降，分析三药联合时，仅是HJD或NIC其中一种药物发挥了体外抑菌增效作用，但二者体内联合应用时是否具备新的增效作用或增效机制，有待深入研究和探讨。

为解决COL耐药率不断增加的问题，COL的抗菌增效剂不断被发现，如氟苯尼考、舍西林、左旋丙嗪、LpxC抑制剂Chir-090及选择性雌激素受体调节剂等［21］，此外抗菌肽MSI-78或OTD-244与COL联用也表现出较好的协同效果［22］。本试验首次从体外研究证实了复方制剂黄连解毒汤也可作为COL的抗菌增效剂，这为临床中西药联用逆转COL耐药提供了更多思路和方法。

4 结论

本研究发现，黄连解毒汤和氯硝柳胺可以有效逆转肺炎克雷伯菌对黏菌素的耐药性，但三药联合体外研究未表现出黄连解毒汤和氯硝柳胺的协同逆转作用，其具体抑菌机制、体内联合作用及增效机制有待深入探讨。