防冻消毒剂在北方冬季畜禽养殖场的抗冻和消杀作用研究

董 娜，杨作丰，许 丹，齐六卫，赵宝凯，谢书宇

1.沈阳市农业综合行政执法队，辽宁沈阳 110031；2.辽宁省农业发展服务中心，辽宁沈阳 110032；3.沈阳伟嘉牧业技术有限公司，辽宁沈阳 110027；4.华中农业大学动物医学院，湖北武汉 430070

1 前言

冬季低温环境不仅有利于环境中病毒、细菌的长期存活，也显著降低了消毒剂的消毒效果[1]，消毒液在室外-6 ℃下会发生冻结无法发挥其消毒作用。此外，在冷冻温度下对畜禽养殖场道路等表面喷洒消毒剂会变得湿滑，易导致养殖场人员的安全事故。

为了有效解决北方冬季消毒剂在低温下因为冻结而不能呈现无消杀作用的问题，项目组通过采用能降低水冰点和增加消毒剂分子扩散能力的无机盐、阳离子活性剂和消毒剂的合理组方，利用多组分间的协同作用开发出在-35 ℃的超低温条件下仍然具有高效消杀作用的防冻消毒剂，为解决我国北方地区畜禽养殖场冬季消毒面临的低温和消毒效果效率差的难题提供新的解决方案。本研究通过抗冻试验测定其防冻能力，并通过琼脂扩散法以及杀菌时间曲线评价其在畜禽养殖场常温和超低温的杀菌活性。

2 材料与方法

2.1 试验材料

防冻消毒剂、戊二醛溶液、碘伏市场采购。

LB肉汤，青岛海博生物科技有限公司。

LB琼脂，青岛海博生物科技有限公司。

金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌保存于国家兽药残留基准实验室(华中农业大学)。

2.2 防冻测试

准确称量防冻消毒剂，并将其配制成质量分数为5%、10%、15%、20%、25%的10 mL溶液，将其放入-70 ℃冰箱，每间隔10 min利用低温温度计测量防冻液的温度，测量每个浓度梯度开始冻结的临界温度，每个浓度3个重复。

2.3 抗菌活性测试

2.3.1 琼脂扩散法

将对数生长期的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌悬液分别稀释至107CFU/mL的浓度，然后将100 µL的稀释细菌悬液均匀地涂布在琼脂培养基的表面。均匀涂布后，在每个琼脂培养皿制作3个孔，分别将200 µL不同稀释浓度的防冻消毒液、碘伏以及戊二醛稀释液加入琼脂培养皿的小孔中。随后，将琼脂培养皿置于37 ℃培养箱中培养16～18 h，观察各孔周围的抑菌圈大小。

2.3.2 低温杀菌试验

将对数生长期的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌悬液加入2 mL LB肉汤中，使其菌液浓度为107CFU/mL。随后将防冻消毒剂、碘伏以及戊二醛稀释液加入上述 LB肉汤中，使防冻消毒剂的最终浓度为5%、10%、20%以及对应浓度的戊二醛和碘液。将含有菌液和消毒剂的试管置于-20 ℃的冷室中，静止孵育12 h将菌液按10倍比稀释后，取100 μL稀释液均匀涂布到琼脂培养皿，在37 ℃下孵育24 h后进行菌落计数。每个浓度重复3次。

3 结果

3.1 防冻作用

防冻试验研究表明，防冻消毒剂具有良好的抗冻和耐低温作用，其在5%、10%、15%、20%和25%浓度下分别抵抗-5、-11、-14、-22、-35 ℃的超低温。上述结果表明，该防冻消毒剂抗冻性能良好，可以有效抵抗-35 ℃的超低温。本品抗冻作用呈现浓度依赖性，随着浓度增加效果显著增强。

3.2 抗菌活性

3.2.1 对金黄色葡萄球菌的杀菌活性

琼脂扩散法研究表明，在加入不同浓度的防冻消毒剂溶液的小孔周围的抑菌圈明显伴随着浓度的升高而增大，表明防冻消毒剂对金黄色葡萄球菌的抑菌效果呈浓度依赖性。

在-20 ℃的低温杀菌曲线试验结果表明，防冻消毒剂杀菌效果极为显著，尤其20%的防冻消毒剂溶液使金黄色葡萄球菌减少了8.59 log，而市售消毒剂戊二醛和碘伏在高浓度下仅使其减少5.7 log和4.34 log。在-20 ℃下5%的防冻消毒剂溶液使金黄色葡萄球菌减少了6.52 log，而戊二醛稀释液仅能降低4.9 log，碘伏几乎对金黄色葡萄球菌无杀灭效果。因此，相比于市售戊二醛和碘液，该防冻消毒剂在不同浓度下对金黄色葡萄球菌的杀灭效果都更为显著。

3.2.2 对大肠杆菌的杀菌活性

杀菌活性试验表明，在高、低浓度下，3种不同消毒剂的微生物抑菌圈依次为：防冻消毒剂＞戊二醛＞碘伏。在不同浓度下，防冻消毒剂抑菌圈均显著大于戊二醛和碘伏。因此，防冻消毒剂在高低浓度下对大肠杆菌抑菌活性均显著强于市售消毒剂戊二醛和碘液在推荐剂量对大肠杆菌的抑菌活性。

在-20 ℃的低温杀菌曲线试验结果表明，防冻消毒剂、戊二醛以及碘伏对大肠杆菌均表现出良好的杀菌活性。在推荐的不同剂量下，防冻消毒剂在杀菌活性均显著大于市售的戊二醛和碘伏。因此，在3种不同消毒剂中，防冻消毒剂对大肠杆菌杀灭作用更加显著。

3.2.3 对沙门氏菌的杀菌活性

琼脂扩散法结果所示，在不同浓度下，3种消毒剂中仅该防冻消毒液有明显的抑菌圈。该防冻消毒液的抑菌圈随着浓度的增大而增加，而戊二醛和碘液不管是在高浓度还是在低浓度的情况下，其抑菌圈均不明显。由此可见，该防冻消毒液在高、低浓度下对沙门氏菌抑菌活性均显著强于市售消毒剂戊二醛和碘液在推荐剂量对沙门氏菌的抑菌活性。

在-20 ℃的低温杀菌曲线试验结果表明，防冻消毒液和戊二醛对沙门氏菌均表现出良好的杀菌效果，而碘伏不管是在高浓度还是低浓度条件下对沙门氏菌几乎没有杀灭效果。尽管戊二醛和防冻消毒液都对沙门氏菌表现出良好的杀菌效果，在推荐使用剂量下的菌落计数计数来看，防冻消毒液更具有优势，尤其是20%的防冻消毒溶液对沙门氏菌的杀灭效果达到10.12 log。因此，防冻消毒液在低温呈现比戊二醛和碘附更强的杀灭作用。

4 讨论

由试验数据可知，该防冻消毒液具有高效的防冻消毒效果，可用于解决低温下消毒的难题，为解决我国北方地区畜禽养殖场在冬季消毒面临的低温冻结和消毒效果差的难题提供新的解决方案，对北方冬季非洲猪瘟等动物疫病的防控提供了技术和产品保障。该防冻消毒剂具有良好的抗冻消毒作用，其在-35 ℃的超低温条件下仍然具备消毒作用。这是因为本品采用无机盐的复配和表面活性的协同作用，在有效降低水的冰点的同时，提升了消毒效果，好于单品的抗冻效果。无机盐溶解于水后，能够降低水的冰点温度，通过阳离子表面活性剂的复配增强了盐离子降低水冰点的能力，在超低温下具有防冻功能。本品抗冻作用呈现浓度依赖性，随着浓度增加效果显著增强。建议在北方冬季使用过程中，根据外界温度合理配制消毒剂浓度。

常规和低温抗菌活性试验研究表明，防冻消毒液在5%～20%的浓度下均呈现强大的杀菌效力，并呈现浓度依赖性。高浓度金属离子、OH-和阳离子表面活性剂复配可使病毒、细菌蛋白变性沉淀，增强其细胞通透性，使微生物体破裂死亡，呈现高效的消杀作用，并且对芽孢具有消杀活性。另外，防冻消毒液溶解后，液体的高流动性和放热作用可加快消毒剂分子的扩散速率，增强消毒剂分子进入微生物体的效率，从而呈现强大的消毒消杀作用。

从防冻和消杀试验结果来看，该防冻消毒液可以为我国北方地区畜禽养殖场在冬季消毒面临的的低温冻结和消毒效果差的难题提供新的解决方案，并为北方冬季非洲猪瘟等动物疫病消毒提供技术和产品支持。