miR-3529-3p通过下调E2F3基因表达抑制卵巢癌SKOV-3细胞增殖的机制研究

2022-02-10 07:26万淑琼鲍群丽黄耿姜艳萍张青冬王楚平
国际医药卫生导报 2022年1期
关键词:试剂盒卵巢癌试剂

万淑琼 鲍群丽 黄耿 姜艳萍 张青冬 王楚平

1鄂东医疗集团黄石市中心医院(湖北理工学院附属医院)妇科,黄石 435000;2鄂东医疗集团黄石市中心医院(湖北理工学院附属医院)检验科,黄石 435000;3鄂东医疗集团黄石市中心医院(湖北理工学院附属医院)泌尿外科,黄石 435000

卵巢癌是女性常见的恶性肿瘤,因其组织结构较为隐蔽,卵巢癌早期的临床特征并不明显,大部分卵巢癌患者初诊时已发生转移,严重威胁女性生命安全[1-2]。卵巢癌的临床治疗主要是手术治疗,然而术后的高复发率严重影响患者预后[3]。寻找早期的诊断标志物及治疗靶标成为卵巢癌研究的重点。微小RNA(miR)是一类保守的单链RNA,属于非编码内源性RNA,长度约为23个核苷酸[4-5]。miR通过在转录后水平影响靶基因的表达,在细胞的生理和病理过程中发挥着重要作用[6-7]。已有大量研究显示,miR作为调控因子参与卵巢癌细胞的增殖、分化、迁移、凋亡等功能[8-9]。2021年1月至5月,本研究拟探讨miR-3529-3p对卵巢癌细胞增殖的影响及作用机制。

材料与方法

1、细胞与主要试剂

DMEM培养基购于美国Gibco公司;NC mimic、miR-3529-3p mimic购于上海碧云天生物技术有限公司;卵巢癌细胞SKOV-3购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库;CCK-8试剂盒购于上海生工生物工程股份有限公司;结晶紫购于美国Sigma公司;Lipofectamine 3000、Opti-MEM培养基购于美国Life Technologies公司;反转录试剂盒和实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)试剂盒购于大连宝生物公司;一抗和辣根过氧化物酶标记的二抗购于美国CST公司。

2、细胞培养和转染

将SKOV-3细胞接种于含10%胎牛血清的DMEM培养基中,于37℃、5%CO2培养箱内培养。在24孔板内接种处在对数生长期的SKOV-3细胞,采用Opti-MEM培养基分别稀释miR试剂和Lipofectamine 3000试剂,充分混匀冰上孵育15 min,分别加预混液至24孔板。转染NC mimic的SKOV-3细胞为NC组,转染miR-3529-3p mimic的SKOV-3细胞为miR-3529-3p组。

3、qRT-PCR检测miR-3529-3p、E2F转录调节因子3(E2F3)mRNA表达

采用TRIzol试剂收集细胞并提取RNA,按照反转录试剂盒和qRT-PCR试剂盒说明书分别进行反转录和qRT-PCR,引物序列如下,E2F3引物正向序列5’-TGACCCAATGGTAGGCACAT-3’,反 向 序 列5’-CATCTAGGACCACACCGACA-3’;miR-3529-3p引物正向序列5’-GTGGGGAGGGAAGGGTCATGCA-3’,反向序列5’-CTTCATCAGCGTCAACAG-3’。以U6为miR-3529-3p的内参基因,以GAPDH为E2F3的内参基因,按照2-ΔΔCt法计算miR-3529-3p、E2F3信使RNA(mRNA)的表达。

4、CCK-8法检测SKOV-3细胞增殖情况

取两组处于对数生长期的SKOV-3细胞制成单细胞悬液,按2×103个/孔接种至96孔板,分别在第1、2、3、4天,每孔加入30μl CCK-8试剂,培养箱继续培养3 h,使用酶标仪检测于450 nm处每孔的吸光度(A)值。每个样本采用4个复孔,实验重复4次。

5、集落形成实验检测SKOV-3细胞增殖能力

取两组处于对数生长期的SKOV-3细胞制成单细胞悬液,按2×103个/孔接种至6孔板,连续培养10 d后,加入甲醇进行固定,加入结晶紫进行染色,流水冲洗多余染液,计数集落形成数。每个样本采用4个复孔,实验重复4次。

6、生物信息学软件预测miR-3529-3p的靶基因

采用miRNAMap数据库(http://mirnamap.mbc.nctu.edu.tw/)预测miR-3529-3p的靶基因,E2F3可能是miR-3529-3p的靶基因。

7、蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测靶基因蛋白的表达

采用细胞裂解液裂解SKOV-3细胞,提取总蛋白,在SDS-PAGE凝胶中进行电泳,采用硝酸纤维素膜进行转膜。采用5%脱脂牛奶封闭,在一抗中孵育过夜,加入二抗并孵育2 h,均匀加入ECL显影液,在凝胶成像仪中显影、拍照。

8、统计学分析

采用SPSS17.0软件进行统计学分析,计量数据符合正态分布,以均数±标准差(±s)表示,两组间比较应用独立样本t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1、各组SKOV-3细胞中miR-3529-3p的表达

SKOV-3细胞转染24 h后,NC组和miR-3529-3p组SKOV-3细胞中miR-3529-3p的表达分别为(1.01±0.07)和(9.55±1.50),miR-3529-3p组相比NC组上调了9.46倍(t=5.68,P<0.01)。

2、miR-3529-3p对SKOV-3细胞增殖活性的影响

与NC组相比,miR-3529-3p组SKOV-3细胞在第2、3、4天时增殖活性均有下降趋势(均P<0.05),表明miR-3529-3p过表达抑制卵巢癌SKOV-3细胞增殖活性(图1)。

图1 高表达miR-3529-3p对SKOV-3细胞增殖能力的影响

3、miR-3529-3p对SKOV-3细胞集落形成能力的影响

NC组和miR-3529-3p组集落形成数分别为(120.50±18.38)个和(56.25±10.78)个,差异有统计学意义(t=3.02,P<0.01),提示miR-3529-3p过表达可抑制卵巢癌SKOV-3细胞的集落形成(图2)。

图2 miR-3529-3p对SKOV-3细胞集落形成的影响(结晶紫染色 ×10)

4、生物信息学软件预测miR-3529-3p的靶基因

如图3,采用miRNAMap数据库预测miR-3529-3p的靶基因可能是E2F3。

图3 miR-3529-3p与E2F3 mRNA的互补配对区域

5、miR-3529-3p对E2F3 mRNA表达的影响

NC组和miR-3529-3p组SKOV-3细胞中E2F3 mRNA的 表 达 分 别 为(1.03±0.14)和(0.27±0.05),表 明miR-3529-3p可抑制E2F3 mRNA的表达(t=5.60,P<0.01)。

6、miR-3529-3p对E2F3蛋白表达的影响

Western blot结果表明,与NC组相比,miR-3529-3p组SKOV-3细胞E2F3蛋白减少,细胞周期相关蛋白CDK4、CDK6表达降低(图4)。

图4 高表达miR-3529-3p对E2F3蛋白表达的影响

讨 论

miR的异常表达与卵巢癌的发生、发展、转移相关[10-11]。miR如miR-29c-3p[12]、miR-34a-5p[13]可通过干扰癌基因表达抑制卵巢癌的增殖,诱导细胞凋亡,增强化疗敏感性,产生抑癌作用。miR如miR-665[14]、miR-378a-3p[10]可通过干扰抑癌基因表达促进卵巢癌细胞的增殖和转移,与患者的不良预后相关,表现为促癌作用。miR-3529-3p在卵巢癌细胞中的作用尚不明确。本研究显示,过表达miR-3529-3p可显著抑制卵巢癌SKOV-3细胞的增殖活性,miR-3529-3p在卵巢癌细胞中表现为抑癌作用。

miRNA序列主要通过与对应靶基因mRNA的3’非翻译区不完全互补,抑制靶基因mRNA的翻译或直接诱导其降解,导致靶基因蛋白表达降低[12]。本研究采用miRNAMap数据库预测,miR-3529-3p和E2F3 mRNA存在互补反应元件。E2F3蛋白属于E2F转录因子家族成员,通过调控细胞周期促进细胞的增殖[15]。E2F3蛋白在膀胱癌、肝癌、胃癌等肿瘤中呈高表达,在细胞的恶性转化中发挥重要作用[16]。E2F3蛋白在卵巢癌癌组织中的表达高于癌旁组织,其表达水平伴随临床分期和肿瘤恶性程度发展而增高,沉默E2F3基因表达可抑制卵巢癌细胞的增殖和顺铂耐药性[15]。本研究显示,过表达miR-3529-3p后SKOV-3细胞中E2F3基因的表达明显降低,表明miR-3529-3p可靶向抑制E2F3的表达,E2F3可能是miR-3529-3p的靶基因。本研究显示,miR-3529-3p抑制E2F3表达后,SKOV-3细胞中细胞周期相关蛋白CDK4、CDK6表达降低,间接提示细胞的增殖活性降低。

综上所述,miR-3529-3p可能通过调控E2F3基因表达抑制卵巢癌细胞的增殖活性,提示miR-3529-3p可能成为卵巢癌靶向治疗的分子靶点。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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