“通督启神”法电针对APP/PS1双转基因小鼠皮层区AMPK、mTOR表达的影响

王帅 孙润权 刘奕志 刘思远 李志刚 王鑫

阿尔茨海默病(alzheimer’s disease，AD)又称老年痴呆，是一种持续侵入型的中枢神经系统退行性疾患。其特征性病理改变为细胞外β-淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ)异常聚积形成淀粉样斑块(amyloid plaques)，神经元内微管相关蛋白tau蛋白过度磷酸化形成神经纤维缠结[1]。至今，据估计全世界有超过5000万人患有痴呆症，死亡率位列第五[2]。

线粒体功能障碍是导致AD发生的重要细胞内变化[3]，当自噬被阻断时，Aβ可以聚集在线粒体膜上，通过改变神经信号因子转导，破坏线粒体结构和自噬功能，引起线粒体损伤和数量变化[4]。另外，自噬缺陷所导致的Tau 蛋白去除受阻，神经纤维缠结可能是AD的基本病理改变之一，Tau 蛋白的过度磷酸化可以导致线粒体脑内分布失衡[5]。前期研究发现，前额叶区腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine 5’-monophosphate (AMP)-activated protein kinase，AMPK)是调控线粒体质量的重要因子[6]，能有效对抗应激反应。此外，AMPK 能有效抑制雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)表信号传导，线粒体损伤相关的AMPK/mTOR途径可以诱导保护性自噬，激活自噬并触发溶酶体系统清除 Aβ[7]。

本实验主要探讨“通督启神”法电针能否通过调控小鼠线粒体自噬因子(AMPK、mTOR)的释放，提高线粒体自噬的活性和质量，从而延缓AD 的病理进程，说明线粒体自噬功能不全可作为AD治疗靶点，为 AD的预防和治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级6月龄雄性APPswe/PS1dE9(Amyloid Precursor Protin/Presenilin-1)双转基因小鼠30只，遗传背景相同的C57BL/6小鼠10只，体质量(28±2)g，购自江苏金致和生物科技有限公司(实验动物许可证号:SCXK(京)99 2014-0004)。饲养于首都医科大学附属北京中医医院中心屏障系统。

1.2 试剂与仪器

3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine，3MA)(货号：HY-19312)(规格：50.0 mg) 上海皓元生物医药科技有限公司； AMPK Alpha Monoclonal(Ptg公司，编号：66536-1-Ig)；MTOR Monoclonal Antibody(ptg公司，编号：66888-1-Ig)；丙烯酰胺，双丙烯酰胺，蛋白质分子量Marker(美国Bio-rad公司，货号：161-0374，310007919)；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司，货号：ZB-2301，批号：128964)；辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司，货号：ZB-2305，批号：129736)

ZYTH2013030504型无菌针灸针 (北京中研太和医疗器械有限公司)；华佗牌电子电疗仪(苏州医疗用品厂有限公司)；XR-XM101型Morris水迷宫图像自动采集和软件分析系统(上海欣软信息科技公司)。

1.3 干预方法

将30只清洁级APP/PS1双转基因小鼠， 随机分为模型组、电针+抑制剂组(线粒体自噬抑制剂为3-MA)和电针组，每组10只，C57BL/6 小鼠10只作为空白对照组。实验全程将实验动物固定于自制鼠板上，使其保持清醒，电针组参照全国针灸学会实验针灸研究会制定的“实验动物针灸穴位图谱”选取百会穴、印堂穴、水沟穴三个穴位，用华佗牌30号1寸毫针进行电针。水沟穴向鼻尖方向点刺，百会穴向下平刺进针、印堂穴向上平刺进针(注意两针尖不要在小鼠体内接触，防止短路)，进针深度为0.5 cm，胶带固定，针柄连接华佗牌电子电疗仪，电针频率为2 Hz，疏密波，电压为2 V， 电流强度为0.2 mA，电针强度以大鼠头部微颤为宜[8]。每次20分钟，每天1次，共治疗15天。

电针+抑制剂组在针刺前30分钟予以2 mg/kg浓度计量的3MA溶于PBS溶液中，腹腔注射，并与电针组进行相同条件的针刺和束缚；

空白对照组、模型组和电针组在干预前30分钟时注射(1.2±0.1) mL PBS溶液。空白组和模型组在电针组束缚治疗时进行同等时间和力度的抓取和束缚；各组小鼠每天上午干预1次，共干预15天。

1.4 Morris水迷宫隐蔽平台实验

实验第1天，让动物在不含平台的水池中自由游泳60秒，上午、下午各1次，使其熟悉迷宫环境。实验时平台位置固定不变，先将动物置于平台上训练10秒，在Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限分别选一固定位置作为入水点，将小鼠面壁放入水中，水迷宫图像自动采集和软件分析系统自动记录小鼠的逃避潜伏期，并选取Ⅲ象限数据进行统计分析，超出60秒没有登台的，其逃避潜伏期自动记60秒，然后人为将小鼠放在平台上学习15秒，每天上午测试1次， 共测试5天，以检测小鼠的空间记忆和学习能力。

1.5 Morris水迷宫空间探索实验

隐蔽平台实验结束以后的第2天上午，撤除Ⅰ象限的平台，在Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限分别选一固定位置作为入水点，将小鼠面壁放入水中，并选取Ⅲ象限数据进行统计分析，水迷宫图像自动采集和软件分析系统自动记录小鼠穿越平台次数，在Ⅰ象限的游泳时间，并计算其与总游泳时间的比值，即目标象限游泳时间/总游泳时间，共测试1天，该实验的目的是检测小鼠的空间记忆能力。

1.6 免疫组化DAB染色

每组随机选取4只小鼠，0.3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔麻醉后，4%多聚甲醛灌注取全脑，放入4%多聚甲醛中固定24小时，石蜡包埋，切片，厚度为6 μm。石蜡切片经常规脱蜡处理后，用枸椽酸缓冲液进行抗原修复15分钟，待凉至室温，PBS漂洗；3%H2O2室温孵育10分钟，PBS漂洗；正常非免疫羊血清37℃孵育10分钟，PBS漂洗；一抗稀释液(AMPK 1∶50；mTOR 1∶100)，放入湿盒，4℃冰箱孵育过夜；第2天PBS漂洗，生物素标记的羊抗兔IgG 37℃孵育10分钟，PBS漂洗；链霉菌抗生物素蛋白—过氧化酶37℃孵育10 分钟，PBS漂洗；DAB显色试剂盒显色，显微镜下观察并终止显色；苏木素复染，酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，晾干，留以观察。以额叶皮层部分为图片分析区域，每组取相互不重叠的6个视野，用 ImageJ对图像分析系统进行图像处理 ，计数其中阳性细胞，每组小鼠所有切片阳性细胞数量作为该组动物免疫阳性细胞密度代表值，以阳性细胞数表示，进一步进行统计分析。

1.7 Western blot 检测小鼠前额叶组织AMPK、mTOR的蛋白表达

检测时取冰冻保存的小鼠海马组织加入裂解缓冲液，研磨均匀后冰上静置20分钟后取上层清液，4 ℃、10 000 r/min、离心10分钟,，提取组织总蛋白样品，使用 BCA 蛋白定量测定试剂盒对蛋白浓度进行测定。剩余蛋白样品加入等体积的2×SDS上样缓冲液,沸水中煮5分钟，充分变性蛋白。SDS-PAGE 电泳，转膜，漂洗5分钟，封闭处理1小时。分别加入一抗(AMPK为1∶3 000；mTOR为1∶500；β-actin 1∶5 000)，4 ℃孵育过夜。洗膜后，加入二抗(AMPK为1∶2 000；mTOR为1∶1 000)，室温孵育 2小时。加入HRPECL发光液，于暗室中X光胶片曝光，显影、定影、标定Marker，最后清水冲洗，晾干，扫描，用IPP软件对扫描图象的目的条带进行灰度分析。以各目的蛋白相对于内参蛋白β-actin 的表达量作为该蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 各组隐蔽平台实验结果比较

重复测量和组间效应方差分析，随训练天数增加，小鼠的逃避潜伏期都有所缩短。对逃避潜伏期做两两比较，模型组长于空白对照组，电针组短于模型组，电针+抑制剂组长于电针组，电针+抑制剂组有短于电针组的趋势，但无统计学意义。见表1，图1。

表1 不同组别逃避潜伏期比较

注：AMPK免疫组化：A1 空白对照组；B1 模型组；C1 电针组；D1 电针+抑制剂组；mTOR免疫组化：A2 空白对照组；B2 模型组；C2 电针组；D2 电针+抑制剂组。

2.2 各组空间探索实验结果比较

各组空间探索实验穿越平台次数及平台象限游泳时间均采用单因素 ANOVA，穿越平台次数，空白对照组明显优于其他三组(P<0.05)，电针组优于电针+抑制剂组(P<0.05)，但电针组和电针+抑制剂组与模型组比较无明显统计学意义。就目标象限游泳时间和目标象限游泳时间百分比而言，空白对照组明显优于模型组和电针+抑制剂组(P<0.05)，电针组优于电针+抑制剂组(P<0.05)，见表2。

表2 不同组别目标象限游泳时间/总时间、穿越平台次数比较

2.3 免疫组化DAB染色结果

AMPK主要表达于小鼠前额叶区的细胞核和胞浆中，以细胞核着色为主，胞浆呈淡染，蛋白阳性区域显色为棕黄色至棕褐色。空白对照组的阳性细胞数多且着色深；模型组的阳性细胞较空白对照组明显减少，且着色浅；电针+抑制剂组和电针组的阳性细胞数介于模型组与空白对照组之间，电针组着色最深。空白对照组的阳性细胞数多于模型组(P<0.05)，电针组多于模型组(P<0.05)和电针+抑制剂组(P<0.05)，模型组多于电针+抑制剂组(P<0.05)。

mTOR主要表达于小鼠前额叶线粒体自噬细胞的细胞器，少数表达与细胞核中，阳性细胞呈淡黄色发散状团块。空白对照组的阳性细胞数少且着色浅；模型组的阳性细胞较空白对照组明显增多，且着色较深；电针+抑制剂组和电针组的阳性细胞数及颜色介于模型组与正常对照组之间。模型组的阳性细胞数多于空白对照组(P<0.05)，模型组与电针+制剂组比较无明显差异，电针组少于模型组和电针+制剂组(P<0.05)，见图1，表3。

表3 各组小鼠前额叶区AMPK、mTOR免疫组化阳性表达比较

2.4 Western blot检测结果

与空白对照组相比，模型组AMPK条带较细，蛋白表达明显较少，mTOR条带增粗，蛋白表达增加，差异均有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，电针组AMPK表达均明显增加(P<0.05)，电针+抑制剂组表达也有所增加，但差异均无统计学意义，电针+抑制剂组与电针组比较其表达明显减少(P<0.05)；电针组mTOR表达明显少于模型组和电针+抑制剂组，差异均有统计学意义(P<0.05)和(P<0.05)，模型组高于电针+抑制剂组(P<0.05)，见表4，图2。

表4 不同组别前额叶区AMPK、mTOR表达水平比较

注：1 空白对照组;2 模型组;3 电针组;4 电针+抑制剂组

3 讨论

本实验结果表明电针干预后实验组AD小鼠空间学习记忆能力较模型组增强，大脑皮层中AMPK蛋白表达水平上调，mTOR蛋白表达水平下调，说明电针干预可以改善小鼠认知能力，调节自噬相关蛋白表达。电针组在行为学方面优于电针+抑制剂组，促进AMPK表达，抑制mTOR表达，说明电针能通过诱导或继发线粒体自噬，增强自噬作用，突破抑制剂作用，起到延缓疾病进展的目的；由线粒体障碍造成的细胞凋亡等一系列细胞症状是加速 AD 患者祌经元受损的生物级联反应之一，线粒体自噬发挥神经保护作用的机制是降解和去除 Aβ 淀粉样沉积及其造成的神经元损伤。同时本实验说明线粒体自噬在分子层面的作用效果和机制，为自噬通路的研究构筑更坚实的实验依据。

在AD中发现的可溶性Aβ和异常磷酸化的Tau蛋白直接与线粒体相互作用并损害其功能，线粒体结构基因、自噬基因和线粒体自噬特异性基因都已被证明以某种方式发生变化[9]。AMPK是生物体内普遍存在的一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，以异源三聚体形式存在[10]，主要协调代谢和能量的需要，是感受细胞能量变化的关键分子, 细胞代谢应激或能量失衡引起 ADP/ATP 或 AMP/ATP 比率升高, 导致AMPK 的激活，进而调控了线粒体的功能, 调控细胞能量循环。AMPK 参与生理和病理状态下的神经保护，从而协调许多组织中特定情境的代谢反应[11]。mTOR是结合线粒体自噬的重要位点。当细胞能量充足时，AMPK处于失活状态，mTOR 处于活化状态，mTOR是与AMPK能量状态相反的感应器，其活性是自噬起效的关键和负性调节因子，在AMPK介导的自噬信号通路中，mTOR 是其下游重要的信号分子。细胞遭受应激损伤过程中 mTOR 即被抑制，主要通过上游AMPK调控激活[12]。神经系统集成各种中央和外围信号以维持体内平衡，神经系统 AMPK 被证明在能量平衡中具有重要且复杂的作用[13]。

“通督启神”针法是以针灸作用基本特点为基础，结合临床实际，总结提炼出的用于治疗神志病的系统化治疗处方[14]。神智病主要病变部位在脑，脑为“神明之府”，主宰人的一切精神意志及思维活动，神失所养则发为神志病。根据“气街”理论，“头气有街，气在头者，止之于脑”(《灵枢·卫气》)，即头部经气与脑联系密切。头为“诸阳之会”，督脉为“阳脉之海”，《灵枢·营气》：“上额，循巅，下项中，循脊，入骶，是督脉也。”《素问·骨空论篇》：“入于脑，上头顶，下额，联系心、肾、脑[15]。”督脉虚衰则肾精无法充盈灌注脑髓，清阳不升，浊阴不降，窍闭神溺，发为“呆病”。因此，在穴位的选取上，以督脉的百会穴、印堂穴和人中穴为主穴。百会又名三阳五会、巅上、天满，根据“四海”理论，“脑为髓海，其气上输脑盖百会穴，下输风府也”。百会穴为督脉经气之所归，清窍神气之所息，为神志病变局部必选穴。印堂，原为经外奇穴，后结合穴位位置与功能被归为督脉，《新集备急灸经》：“患大风病，两眉中名光明穴，灸随年。”具有清利头目、开窍醒神益智的功效，调和阴阳气机，达到阴平阳秘的生理状态。人中穴又名沟洫、寿堂、子庭，《神应经》云:“善悲哭忧不休, 针百会、人中。”又为十三鬼穴中的鬼宫，鬼穴为《千金要方》所载，是古代治疗神志疾患的十三个经验效穴[16]。此三穴皆为头部腧穴，符合“腧穴所在，主治所在”的局部选穴原则；皆为督脉腧穴，同气相求；也是符合神志病的病因病机的辨证对症选穴，位置与辨证相宜。选此三穴为伍，通督以启神，方能调阴与阳，精气乃光，合形与气，使神内藏。

综上所述，实验可见，本实验应用3MA线粒体自噬抑制剂可延缓AD小鼠认知能力改善，弱化电针对小鼠前额叶区相应蛋白水平的调节，说明AD的发病机制可能与线粒体自噬有十分紧密的关联。与此同时，AMPK/mTOR这一负性调节环路在自噬发生和发展过程中也起到了重要作用，为自噬研究提供了新的参考。

本实验就“通督启神”法电针对AD的治疗作用及作用途径进行了分子层面的验证，但线粒体自噬这一重要的细胞内事件的激活、形成、凋亡，是否呈有规律的起落消涨现象，以及各个过程和现象间的相互影响作用，仍是医疗生物界有待攻克的主题和难题，进行更深层次的研究与讨论是总结AD治疗策略的必经之路。