重楼皂苷抗胶质瘤作用机制的研究进展

郑淑娴 邱鹏程 王媛媛 杜洋 薛玉叶 孙光强 陆云阳 汤海峰

脑胶质瘤(神经胶质瘤)约占所有原发性脑肿瘤和其他中枢神经系统肿瘤的26%，占恶性脑肿瘤的81%，其患者的中位生存期为12～15个月，确诊后的5年生存率约为5%[1]，具有发病率高、复发率高、致残率高、死亡率高和治愈率低的“四高一低”特点[2]。临床常用治疗手段包括手术、化疗和放疗，但目前临床一线化疗药如替莫唑胺等耐药性普遍，作用机制单一，即使与其他化疗药物如贝伐单抗等联合用药的治疗效果亦不够理想[3]。因此，开发安全有效的新型抗胶质瘤药物具有十分重要的意义。

重楼属(Paris)植物为多年生草本植物，属于延龄草科(Trilliaceae)，现多归为百合科(Liliaceae)。2020版《中华人民共和国药典》收载的中药重楼(Paridis Rhizoma)是云南重楼[ParispolyphyllaSmith var.yunnanensis(Franch.)Hand. Mazz.]和七叶一枝花[Paris.polyphyllaSmith var.chinensis(Franch.)Hara]的干燥根茎，具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊的功效[4]。已从重楼属植物中分离得到的化学成分包括甾体皂苷类化合物、C21甾体皂苷、五环三萜皂苷、植物甾醇以及黄酮等[5]。甾体皂苷类化合物是重楼属植物的主要活性成分，亦总称为重楼皂苷，其药理活性有抗肿瘤、抗菌、抗心肌缺血、抗氧化、免疫调节和止血等[6]。重楼皂苷在抗肿瘤方面多有报道，对乳腺癌、卵巢癌、胃癌及喉癌等多种癌症均有显著抑制作用[7]。近年来，对重楼皂苷抗胶质瘤的研究也逐步增多，已报道的具有抗胶质瘤活性的单体包括重楼皂苷I(D)[8-9]、Ⅱ[10]、Ⅲ(薯蓣皂苷)[11]、Ⅵ[12]、Ⅶ[13]和H[14]等(见表1，化学结构式见图1)，但目前尚无综述对其作用机制进行总结。本文对重楼皂苷抗胶质瘤的作用机制进行综述，以期为重楼皂苷抗胶质瘤活性的深入研究提供参考。

1 诱导细胞程序性死亡

1.1 诱导细胞凋亡

细胞凋亡是一种高度调节的程序性细胞死亡过程，通过有序有效地清除受损或有害的细胞，在维持组织内环境稳态中发挥重要作用。细胞凋亡的过程大致可分为以下几个阶段：首先是细胞接受凋亡信号，凋亡信号调控分子间相互作用，从而调节含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)的活性，继而进入连续的反应过程。因启动阶段的不同，细胞凋亡往往又通过三种通路来实现，分别为线粒体通路、死亡受体通路和内质网通路[17]。

表1 具有抗胶质瘤活性的7种重楼皂苷

图1 具有抗胶质瘤活性的7种重楼皂苷化合物结构式

1.1.1 线粒体通路 在重楼皂苷抗胶质瘤的作用机制中，最常出现的凋亡通路为线粒体通路，又称为内在途径。B细胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)家族蛋白在线粒体信号通路中发挥至关重要的作用[18]，其中BCL-2相关X蛋白(BCL2-Associated X，Bax)是一种促凋亡蛋白，当Bax高表达时，可促使细胞发生凋亡[19]；Bcl-2是一种抗凋亡蛋白，当Bcl-2高表达时，Bcl-2与Bax形成异源二聚体，抑制细胞凋亡[20]，所以细胞内Bcl-2/Bax的比例决定了细胞凋亡的敏感性，从而改变线粒体膜的通透性，致使跨膜电位降低，细胞色素C(cytochrome C，Cyt-C)被释放。Cyt-C是线粒体凋亡途径中关键的调节因子[21]，它可与凋亡蛋白酶活化因子(apoptotic protease activating factor-1，Apaf-1)结合，激活Caspase家族中的Caspase-9，进而激活下游蛋白Caspase-3和Caspase-7，从而诱导细胞凋亡[22]。

化合物1通过靶向STAT3抑制胶质瘤细胞的增殖，并降低线粒体膜电位，诱导U251细胞发生凋亡[23]。化合物1还可通过上调Bax和Caspase-3的蛋白表达，降低Bcl-2的蛋白表达，从而诱导U87胶质瘤细胞发生凋亡[24]。化合物3可以诱导促凋亡调节因子(programmed cell death 5，PDCD5)核易位，造成C6胶质瘤细胞DNA和线粒体损伤，下调Bcl-2和Bcl-xl的蛋白表达，上调Bax、Bak和Bid的蛋白表达，使 Bcl-2/Bax比值降低，通过激活线粒体通路诱导细胞凋亡从而抑制细胞增殖[25]。化合物3也可诱导胶质瘤U87MG细胞发生凋亡，其分子机制为上调过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)的mRNA和蛋白表达水平，上调Bax蛋白表达水平，下调Bcl-2蛋白表达，造成Bcl-2/Bax的比值减小，诱导凋亡发生从而抑制细胞增殖[26]。化合物4诱导胶质瘤细胞发生凋亡是通过增加Bax、Caspase-3、8和9的表达水平，降低Bcl-2的表达水平[27]。化合物6可显著上调SHG44R细胞中凋亡相关蛋白Bax和Cleaved Caspase-3的表达水平，降低Bcl-2的表达水平，使SHG44R胶质瘤细胞通过线粒体通路发生凋亡[28]。

线粒体是产生活性氧(reactive oxygen species，ROS)的重要部位，线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential，MMP)的稳定与细胞内ROS的水平密切相关[29]。ROS的累积能破坏线粒体膜，诱导MMP变化，而MMP的稳定有利于维持细胞的正常生理功能[30]。化合物7能增加胶质瘤LN229细胞内ROS水平，并诱导LN229细胞MMP降低，通过ROS介导的线粒体凋亡途径诱导细胞凋亡[16]。化合物2诱导胶质瘤细胞凋亡也是通过ROS介导的，经化合物2处理后，U87和U251细胞中Bcl-2、AKT和P-AKT的水平降低，Cyt-C、Bax、Caspase-3和Cleaved Caspase-3的水平升高，最终，通过ROS介导的线粒体通路诱导胶质瘤细胞死亡[31]。

1.1.2 死亡受体通路 死亡受体通路又称为外源性途径。在此途径中，死亡受体相关蛋白有TNFR、Fas(CD95、Apo1)和DR3(Apo3)等[32]，相应的死亡配体分别为TNF、FasL(CD95L)、Apo-3(DR3L)和Apo-2L(TRAIL)等[33]。受体与膜上相应的配体结合导致细胞膜中Fas相关死亡域蛋白(Fas-associated with death domain protein，FADD)和TNF-R1相关死亡域蛋白(TNFR1-associated death domain protein，TRADD)聚集，形成凋亡诱导复合物(death-inducing signaling complex，DISC)。DISC包括受体复合物、配体复合物、引发剂procaspase-8、procaspase-10以及其他几种调节因子和辅助因子[34]。被激活的Caspase-8/10进而激活下游效应器，引起细胞凋亡。

化合物1不仅可以增加胶质瘤U251细胞线粒体膜的通透性，引起线粒体功能障碍，诱导U251细胞通过线粒体通路凋亡，还可以增加胞内c-jun-氨基末端激酶(c-jun-NH2-terminal kinase，JNK)的蛋白表达，通过激活JNK信号通路，促进U251人脑胶质瘤细胞凋亡[35]。在胶质瘤U251细胞中，化合物1和化合物2还能通过促进Fas蛋白的表达，进而上调Caspase-8的水平，从而激活下游蛋白Caspase-3及其通路，诱导胶质瘤细胞通过外源性途径凋亡[36]。在神经母细胞瘤NB-69细胞中，化合物1诱导的细胞死亡是通过RIPK1、RIPK3、FADD和caspase 8之间形DISC，当Caspase-8被激活，RIPK1和RIPK3不被激活时，会导致细胞凋亡[37]。化合物1也可通过上调细胞内Caspase-8的水平，促进NB-69细胞通过外源性途径凋亡[38]。化合物1还可以通过上调p-JNK和t-JNK的蛋白表达，诱导U87人脑胶质瘤细胞通过JNK途径凋亡[24]。JNK途径是诱导细胞通过死亡受体通路凋亡的主要途径之一。

1.1.3 内质网通路 内质网是细胞内蛋白质合成的主要场所，也是Ca2+的主要储存库[39]。当内质网内钙离子平衡被破坏或者浓度改变时，会激活内质网膜上的相关蛋白进而引发细胞凋亡[40]。目前尚未有重楼皂苷通过内质网途径诱导胶质瘤细胞凋亡的报道。

1.2 诱导细胞焦亡

细胞焦亡是由炎性小体引发的一种细胞程序性死亡，又称为细胞炎性坏死。细胞焦亡的发生依赖于炎性Caspase和GSDMs蛋白家族[41]。其特征是激活Caspase-1形成质膜孔，导致促炎细胞因子的释放和细胞裂解。细胞通过释放促炎内容物如白细胞介素(interleukin，IL)-1β和IL-18扩大或维持炎症[42]。

化合物6能够显著增加胶质瘤SHG44R细胞中Caspase-1、Caspase-11、GSDMD、IL-1β、IL-18和NLRP3的mRNA表达量，上调Cleaved Caspase-1、CleavedN-terminal-GSDMD、IL-1β、IL-18和NLRP3蛋白水平，从而诱导胶质瘤细胞焦亡[28]。

1.3 诱导细胞坏死

细胞坏死是由细胞直接损伤引起的，其机制为：肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)和脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导的含有受体相互作用蛋白激酶1(receptor interacting protein kinase 1，RIPK1)的复合物形成，RIPK1、RIPK3、FADD和Caspase-8之间形成复合物，当Caspase-8未被激活时，RIPK1和RIPK3被激活，MLKL(RIP3底物混合谱系激酶样结构域)被磷酸化，与细胞膜结合并形成一个孔，使细胞膜被破坏，导致细胞坏死性死亡[43-45]。Watanabe S等[38]发现化合物1可以诱导RIPK1、RIPK3、FADD和caspase-8形成复合物，并通过复合物途径诱导胶质瘤IMR-32和LA-N-2细胞坏死。

2 诱导细胞周期阻滞

细胞周期是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程。一个完整的细胞周期是由DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)、DNA合成后期(G2期)、细胞分裂期(M期)和G0期所组成[46]。

调节细胞周期是维持体内平衡的关键，细胞间或细胞内通过信号传递保持细胞增殖和死亡平衡[47]。与细胞周期密切相关的蛋白有细胞周期蛋白(Cyclins)和细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶(cyclin-dependent kinases，CDKs)。在细胞周期的不同时期，不同的Cyclin-CDK复合物驱动着细胞周期的运转。为了避免细胞的无限增殖，细胞周期中存在抑制系统，即CDKs抑制蛋白，包括P15、P16、P18、P19，以及P21、P27和P57。细胞周期进展受多个细胞周期检查点的限制，检查点可能会引起细胞周期停滞，从而使细胞增殖延迟[48-50]。

用不同浓度(2、3、4、5、6、7、8和9 μM)的化合物1处理U251胶质瘤细胞24、48和72小时，发现化合物1能以剂量和时间依赖性方式显著抑制胶质瘤细胞生长，并使细胞G2/M期细胞增多，G0/G1期细胞减少，表明化合物1在G2/M期诱导U251胶质瘤细胞阻滞[35]。化合物3通过调节DNA拓扑异构酶Ⅰ、P53、CDK2和Caspase A的表达，诱导C6胶质瘤细胞在G0/G1期数量减少，而S期的细胞数量增加，表明化合物3可诱导胶质瘤细胞在S期周期停滞[25]。用不同浓度(0、10、20、30、40和50 μM)的化合物3处理胶质瘤U87MG细胞48小时，经Western blot检测发现Cyclin D1和Cyclin E1蛋白表达下降，诱导胶质瘤细胞在G0/G1期阻滞[26]。化合物4通过下调细胞Cyclin B1的水平，使细胞在G2/M期累积，影响细胞周期进展从而抑制胶质瘤细胞生长增殖[27]。用25、50或100 g/mL化合物6处理U251胶质瘤细胞能上调P21和P27蛋白的表达水平，抑制Cyclin D1和S期激酶相关蛋白2(S-phase kinase associated protein，Skp2)蛋白的表达，使细胞在G1期聚集，在S期和G2期细胞数量减少，诱导胶质瘤细胞周期停滞在G1期[51]。

与非耐药株相比，耐替莫唑胺的胶质瘤细胞株可能具有自发性的周期阻滞现象，这可能帮助耐药株抵抗替莫唑胺的化疗药物压力。用不同浓度(0.125、0.25、0.5、1、2、4、8和16 μg/mL)化合物5处理U87R和SHG44R胶质瘤细胞后，发现化合物5能剂量依赖性抑制胶质瘤细胞增殖 ，并且上调Cyclin D1的蛋白表达，下调周期抑制蛋白P21和P27的水平，打破耐药胶质瘤U87R和SHG44R的自发性周期阻滞现象[52]。

3 诱导细胞自噬

自噬是一种细胞分解代谢的过程。在此过程中，细胞自身蛋白质和细胞器被隔离成囊泡，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物[53]，因此被认为是一种新型的程序性细胞死亡，又称为 Ⅱ 型程序性细胞死亡[54]。

与自噬有关的细胞因子如微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)、自噬相关基因Beclin-1和泛素结合蛋白P62。LC3是自噬标记物，分为LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ两个亚型。LC3-Ⅰ是一种可溶性蛋白质，细胞发生自噬时，游离在细胞质中的LC3-Ⅰ会与自噬体膜表面的磷脂酞乙醇胺结合形成LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ是自噬体膜的必需组分，能与自噬体膜稳定结合。自噬体与溶酶体融合后，自噬体内成分被溶酶体降解，同时LC3-Ⅱ也被降解，所以LC3-Ⅰ与LC3-Ⅱ的量反映了自噬的发生过程及程度[55-56]。P62是一种典型的自噬受体，它参与泛素化蛋白质的蛋白酶体降解，蛋白酶体抑制引起的蛋白毒性应激可通过P62磷酸化来激活自噬[57]。Beclin-1是自噬过程中关键的调控蛋白[58]，是第一个被发现能够介导自噬的哺乳动物因子，也是自噬体形成所需的上游分子[59]。调控自噬过程的常见通路有：AMPK-mTORC1通路、PI3K/AKT/mTORC1通路和Ras/Raf/MEK/ERK通路。

LIU W等[27]通过Western blot发现化合物4可以上调LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白的表达水平，从而诱导胶质瘤细胞自噬。化合物5能增加LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率，降低P62蛋白水平，可能通过抑制AKT/mTORC1信号通路来诱导胶质瘤细胞自噬，ROS的过度产生抑制AKT活性，进而抑制mTORC1复合物活性[60]。

4 抑制细胞迁移与侵袭

肿瘤细胞向周围组织和血管的侵袭和迁移是肿瘤转移的关键步骤，肿瘤转移是癌症患者死亡的主要原因。细胞的侵袭和迁移主要与上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)有关[61]，肿瘤细胞在EMT过程中，其上皮标记物钙黏蛋白E-cadherin会显著减少，间充质标记物N-cadherin、波形蛋白(Vimentin)和Snail蛋白的表达会增加[62]，使得细胞骨架变为波形细胞骨架，导致癌细胞黏附能力减弱、侵袭迁移能力变强。

化合物2处理过的胶质瘤细胞迁移侵袭能力明显下降。经Transwell实验检测，高剂量和低剂量化合物2均能显著抑制U87和U251胶质瘤细胞的迁移和侵袭[31]。化合物6也经Transwell实验和侵袭实验显示对U251胶质瘤细胞有抑制迁移和侵袭的作用[51]。化合物2还能通过抑制Snail的表达水平，促进E-cadherin表达水平升高，进而抑制胶质瘤T98G和LN18细胞的侵袭能力[63]。化合物4通过促进胶质瘤细胞中E-cadherin蛋白的表达，下调N-cadherin蛋白的水平从而抑制胶质瘤细胞的迁移与侵袭[27]。化合物5通过下调N-cadherin、β-catenin、转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)和Smad2的蛋白水平呈剂量依赖性抑制胶质瘤细胞的迁移[52]。

表2 重楼皂苷的抗胶质瘤作用及机制概览

5 联合用药及逆转耐药

临床治疗胶质瘤过程中，化疗药物的耐药性是治疗失败的主要原因之一[64]。常用传统化疗药物有卡莫司汀、顺铂和替尼泊苷，但它们的有效率只有20%左右。最新化疗药物替莫唑胺(temozolomide，TMZ)的有效率也只有35%[65]，并且重复使用亚致死量可诱导胶质瘤耐药性[66]。据报道，重楼皂苷对耐药胶质瘤有显著的治疗作用，与TMZ联合使用，协同作用明显，能降低胶质瘤细胞对TMZ的耐药性。

0.4 μmol/L 化合物5 和90 μmol/L TMZ联合处理U251胶质瘤细胞会导致 MGMT mRNA 表达水平显著下调，细胞死亡率高达 80%，表明化合物5可以通过抑制 MGMT 的表达从而降低胶质瘤细胞对TMZ的耐药性[67]。0.4 μmol/L化合物5与TMZ联合处理胶质瘤U251和U87MG细胞，能增加TMZ对胶质瘤细胞的毒性，使胶质瘤细胞对TMZ敏感[60]。化合物5还能抑制TMZ耐药胶质瘤细胞SHG44R和U87R增殖和迁移[52]。化合物6也能诱导耐TMZ胶质瘤SHG44R细胞凋亡，抑制细胞生长增殖[28]。

6 讨论

重楼在中国分布广泛，具有悠久的药用历史。在民间重楼被用作抗癌药物，包含重楼的中成药如楼莲胶囊和金复康口服液常用于癌症的辅助治疗，以提高疗效和减少副作用[68-69]。药理研究表明重楼具有多种活性，其主要的活性成分为重楼皂苷。近年来，重楼皂苷的抗肿瘤作用广受关注，但目前对重楼皂苷抗胶质瘤作用及机制的研究相对较少，尚无相关总结。本文对重楼皂苷抗胶质瘤的作用及机制进行综述，总结其抗胶质瘤的作用机制主要包括：(1)诱导胶质瘤细胞程序性死亡(如凋亡、焦亡和坏死等)； (2)抑制胶质瘤细胞增殖及诱导细胞周期阻滞；(3)诱导胶质瘤细胞自噬；(4)抑制胶质瘤细胞迁移侵袭；(5)联合用药逆转胶质瘤细胞耐药性，增加胶质瘤细胞对化疗药物的敏感性。已发现的具有抗胶质瘤活性的单体包括重楼皂苷I(D)、Ⅱ、Ⅲ(薯蓣皂苷)、Ⅵ、Ⅶ和H等。这些作用机制的研究涵盖了胶质瘤细胞恶性生物学行为的多个方面和临床治疗中的难点，也再次证实了中药通过多靶点和多通路发挥抗肿瘤作用的特性。这些研究不仅初步揭示了重楼皂苷抗胶质瘤的化学成分、相关蛋白与信号通路，并将相关蛋白或信号通路与重楼皂苷中的单体化合物对应起来，有助于深入认识重楼皂苷发挥抗胶质瘤活性的构效关系。

目前对重楼皂苷抗胶质瘤的研究尚较为粗浅，对活性皂苷大多仅检测了细胞表型(见表2)，对其作用机制的研究也主要是通过Western blot等方法测定了细胞表型中的相关蛋白，未通过基因表达谱芯片等技术对其抗胶质瘤过程中的功能基因进行全面探讨。目前，从重楼属植物中已发现了数以百计的甾体皂苷成分，但开展过抗胶质瘤活性筛选的皂苷屈指可数，所发现的7种抗胶质瘤皂苷缺乏结构多样性，导致构效关系尚无法明确。此外，由于皂苷本身具有溶血特性和注射毒副反应，导致多数实验研究止步于细胞水平。今后，应对已发现的重楼皂苷进行抗胶质瘤活性普筛，在结构多样性的基础上阐明其全面的药理活性和具体作用途径，进而建立系统的重楼皂苷抗胶质瘤的构效关系结论。同时，可通过尝试不同剂型和给药方式如间质化疗[70]等来规避重楼皂苷的溶血毒副反应。综上所述，要将重楼皂苷开发为抗胶质瘤新药并指导临床应用，需进一步加大对重楼皂苷抗胶质瘤作用及机制研究的深度和广度。