TGF-β1、Smads在子宫内膜异位症中的表达和意义

李冰冰 谢苗 郭亚楠 和翔宇 刘雁峰

子宫内膜异位症(Endometriosis，EMs)为子宫内膜组织(腺体和间质)在子宫腔被覆内膜及子宫以外的部位出现、生长、浸润，反复出血，继而引发疼痛、不孕及结节或包块等[1]。卵巢子宫内膜异位囊肿(又称巧克力囊肿)的形成是由种植于卵巢表面的子宫内膜组织向卵巢皮质的浸润内陷生长，在卵巢激素的影响下，异位内膜周期性出血，逐渐长大形成假囊，向卵巢深部扩张，压迫周围卵巢组织，诱发局部炎症反应，伴纤维细胞增生及纤维化[2]。研究[3]显示巧克力囊肿囊壁中存在的致密纤维化带，增加了手术过程中囊肿与卵巢的剥离困难程度，同样也导致了剥离正常卵巢组织的风险。所以巧克力囊肿对卵巢功能损伤的主要原因，一是异位病灶本身对卵巢皮质的浸润直接损伤了卵巢组织，异位囊肿的压迫和周围纤维化的形成和炎症反应又影响了卵巢的正常血供；再者就是异位囊壁中致密纤维化带的存在增加了手术剥离的困难，导致剥离时难免携带正常卵巢组织[4-5]。

目前关于子宫内膜异位症纤维化形成的机制尚不清楚，TGF-β1是引发纤维化形成的关键因子，可通过Smads蛋白家族的介导引发致纤维作用，研究显示在多种纤维化疾病中起着重要的作用[6-8]。本研究采集巧克力囊肿患者异位囊肿囊壁组织、在位内膜和其它卵巢良性肿瘤患者的内膜组织，通过检测三种组织纤维化形成情况及TGF-β1、Smads的表达水平，初步探讨TGF-β1、Smads在EMs中的表达和意义。

对象与方法

一、研究对象

收集2016年9月至2019年1月收治的巧克力囊肿腹腔镜手术患者20例(Ⅲ～Ⅳ期)，取其卵巢子宫内膜异位囊肿囊壁组织作为卵巢异位症囊壁组，对于其中9例行宫腹腔镜联合手术的患者，再取其在位内膜组织作为子宫在位内膜组；同时期因其他卵巢良性肿瘤行宫腹腔镜联合术者9例，取其子宫内膜组织作为子宫内膜对照组。所有纳入本研究的患者术后均经病理明确诊断。

1. 纳入标准：(1)年龄20岁～49岁，未绝经者；(2)术前均行彩超或者CT等影像学检查，支持卵巢肿瘤的诊断；(3)病理检查明确诊断为卵巢子宫内膜异位囊肿或其他卵巢良性肿瘤。

2. 排除标准：(1)术前3个月内接受激素治疗；(2)合并有心血管、肝、肾和造血系统等疾病、精神病患者；(3)合并生殖道恶性肿瘤、乳腺癌等雌激素依赖性疾病、肿瘤或急性炎症。

3. EMs诊断标准：EMs诊断标准参照2015年中华医学会妇产科学分会子宫内膜异位症协作组制定的《子宫内膜异位症诊治指南》[1]：经腹腔镜手术肉眼可见典型病灶，并结合病理检查确诊为EMs；病理诊断标准：病灶中可见子宫内膜腺体和间质，伴有炎症反应及纤维化。

二、方法

1.信息采集：所有研究对象采集年龄、月经婚育史、现病史、既往病史及用药史等信息。

2.样本采集：巧克力囊肿患者共20例，术后采集其异位囊肿囊壁组织；其中有9例巧克力囊肿患者行宫腹腔镜联合术，同时采集其宫腔刮出物；其它行宫腹腔镜联合术的卵巢良性肿瘤患者9例，采集宫腔刮出物。将获取的组织放置于多聚甲醛溶液中进行固定。

3.观察指标与评价标准：以苏木精和伊红染色方法(HE染色法)染色，采用显微镜观察卵巢异位症囊壁组、子宫在位内膜组和子宫内膜对照组的组织形态学；采用Masson染色法来判断卵巢异位症囊壁组、子宫在位内膜组和子宫内膜对照组的纤维化形成情况；采用免疫组织化学法检测卵巢异位症囊壁组、子宫在位内膜组、子宫内膜对照组组织中TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7的表达情况。专业图像分析系统Image-Pro Plus对三组的免疫组化切片进行分析，以平均光密度值(MOD，MOD=IOD/Area)作为TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7表达强度的评价参数,在200倍拍摄倍数下，每张切片随机观察3个视野,取平均值作为每张切片的观察结果。

4.主要实验试剂：MASSON三色染色试剂盒(珠海贝索生物技术有限公司，BA-4079A)，一抗(Tgfb1)(Abcam,ab92486)，一抗(p-samd2/3)(Abcam,ab63399)，一抗(samd7)(Santa,sc-365846)。

5.主要实验器材：石蜡包埋机(沈阳市龙首电子仪器有限公司，LS-100)，全景扫描仪(3DHISTECH，Pannoramic MIDI)，显微镜(麦克奥迪实业集团公司，BA400)，摄像装置(麦克奥迪实业集团公司，Moticcam 2306)，成像软件系统(麦克奥迪实业集团公司，Motic Images Advanced 3.2)。

结 果

一、基线资料比较

卵巢异位症囊壁组、子宫在位内膜组、子宫内膜对照组患者的年龄、初潮年龄、月经周期、妊娠史均无统计学差异。见表1。

表1 三组患者的基线资料

二、组织学表现

1.HE染色：子宫内膜异位症的异位内膜组织包含子宫内膜腺体、子宫内膜间质、纤维素以及富含含铁血黄素的巨噬细胞等4种成分[2]。HE染色结果显示，卵巢子宫内膜异位囊肿内壁可见子宫内膜样上皮细胞，上皮层下可见内膜间质细胞，部分异位囊内壁上皮细胞不完整、稀少；囊壁可见致密结缔组织，存在纤维组织的增生，伴有间质内灶状新鲜出血或陈旧出血。见图1。

2. Masson染色：组织切片经Masson染色后，镜下观察表现蓝染区域为纤维化。染色结果显示卵巢异位症囊壁组织内均可见明显的蓝染区域，即表明纤维化沉积；而子宫在位内膜组、对照内膜组的组织中，均未见到明显纤维化蓝染区域。见图1。

图1 组织形态学

三、免疫组织化学结果

1.表达定位：TGF-β1、p-Smad2/3在卵巢异位症囊壁组、子宫在位内膜组和子宫内膜对照组中均有表达，主要表达在腺上皮细胞和间质细胞细胞质中；Smad7在卵巢异位症囊壁组、子宫在位内膜组和子宫内膜对照组中均有表达，但在卵巢异位症囊壁组表达较弱，主要表达在腺上皮细胞细胞质中。见图2。

2. 表达结果：卵巢异位症囊壁组TGF-β1表达水平最高，但与子宫在位内膜组之间无统计学差异，与子宫内膜对照组之间表达有统计学差异性；子宫在位内膜组TGF-β1平均表达水平高于子宫内膜对照组，但无统计学差异。卵巢异位症囊壁组p-Smad2/3表达最高，但与子宫在位内膜组之间无统计学差异；子宫内膜对照组p-Smad2/3表达最低，与卵巢异位症囊壁和子宫在位内膜组之间均有统计学差异。卵巢异位症囊壁组Smad7的表达含量最低，与子宫在位内膜组和子宫内膜对照组差异均有统计学意义；子宫在位内膜组Smad7的表达含量较对照内膜组低，差异有统计学意义。见表2、图2。

表2 各组免疫组化结果

讨 论

巧克力囊肿异位病灶周期性的反复出血，囊内压力增大，异位囊肿逐渐浸润并压迫附近的卵巢基质，并刺激邻近组织发生炎症反应，逐渐造成周围组织纤维化。因纤维化形成而致粘连，增加了手术剥离困难，从而增加了对卵巢功能的损伤。研究[3，9]显示畸胎瘤囊壁中存在致密纤维化带和疏松带，而巧克力囊肿囊壁只存在致密的纤维化带，且异位囊壁纤维化致密带和卵巢皮质的厚度均厚于畸胎瘤，致密纤维化带应该是增加手术剥离异位囊肿困难的原因，卵巢组织存在被携带剥离的可能。另一方面，异位病灶的浸润性生长导致了卵巢皮质的损伤，从而对卵巢功能产生影响[10]。已有研究显示巧克力囊肿卵巢组织中发生了纤维化和炎症，继而伴随着血管化减少和氧化应激增加[11]，这也可能是导致卵泡激活和随后卵泡丢失的原因。

TGF-β1主要由巨噬细胞分泌，参与组织的纤维化作用，可促进间质细胞的生长，增加ECM的形成，能够明显地促进纤维母细胞增生、胶原的沉积，在肺纤维化、肝纤维化和心脏纤维等疾病中均起着一定的致纤维化作用[6-8]。相较于野生型小鼠，TGF-β1缺失小鼠的子宫内膜异位病变重量、腺上皮比例、巨噬细胞和α平滑肌肌动蛋白阳性肌成纤维细胞的丰度均降低[12]。高水平的TGF-β1是子宫内膜异位症异位病变发展的重要调节因子，可增强子宫内膜异位细胞或组织的迁移、粘附、侵袭性和定殖潜力[13]。Smad介导的TGF-β1是引起纤维化的最重要信号传导途径之一。Smad2和Smad3是受体调节型Smad，可被Ⅰ型受体直接磷酸化激活，p-Smad2/3和通用型Smad结合成多聚体转移至细胞核，然后调节靶基因转录；Smad7作为抑制型Smad可阻止Smad信号传导。研究[14]显示Smad3在TGF-β1致肝纤维化疾病中发挥着重要作用，可促进ECM的产生增加。Smad7还可以和TGF-β受体I竞争性结合，从而对Smad2或Smad3的磷酸化产生抑制，阻断TGF-β信号的后续传导[15]。

本研究结果显示，与子宫内膜对照组相比，卵巢异位症囊壁组和子宫在位内膜组TGF-β1的表达水平高，TGF-β1可促进纤维母细胞增生、胶原沉积，导致内异症纤维化的形成。与对照内膜组相比，卵巢异位症囊壁组和子宫在位内膜组中存在p-Smad2/3的高表达，而Smad7的表达相对低。研究结果推测p-Smad2/3参与子宫内膜异位症疾病，在促进异位细胞增殖分化、血管生成和纤维化形成中起到一定的作用。作为抑制型的Smad7在异位囊壁和在位内模组中的低表达，可能表明Smad7对Samd介导的TGF-β1信号通路抑制减弱，从而Smad介导TGF-β1信号通路的致纤维化作用增强，促进了子宫内膜异位症纤维化的形成。TGF-β1/Smads通路在多种疾病的纤维化形成中起着关键作用，相关研究也逐渐证实，其在子宫内膜异位症中的作用还有待深入的研究。纤维化形成是子宫内膜异位症的主要病理特点之一，以纤维化为切入点，可有望为子宫内膜异位症发病机制和治疗的研究提供一个新的视角。