早期冠状动脉粥样硬化患者血浆代谢组学研究

孙萌，刘伟，刘海霞，于波

冠状动脉粥样硬化的临床诊断一直备受关注。目前冠状动脉造影是其诊断的“金标准”[1]，但操作有创伤性、成本高，并伴有副作用的产生，严重限制了其应用规模。现有的一些传统生物标志物（如超敏C 反应蛋白等）又不能很好地判定疾病的发生，时常导致漏诊或误诊。因此，迫切需要一种能够发现特异性生物标志物的方法，为疾病的早期诊断提供更有价值的参考指标。

代谢组学的研究对象是处于代谢途径末端的内源性小分子化合物，可以更直接、准确地反映机体状态，故代谢组学为发现潜在生物标志物提供了新方法。目前代谢组学已经广泛应用于心血管疾病的临床诊断与发病机制研究[2-5]，但对于早期冠状动脉粥样硬化患者血浆中生物标志物的研究却鲜有报道。吕晓鹏等[6]、张冬伟等[7]利用代谢组学技术探讨早期动脉粥样硬化患者的血液生物标志物。然而，这些研究均以健康志愿者作为对照者，对照组缺乏血管狭窄程度的客观证据，并且试验样本量均较小，使得筛选出的生物标志物存在假阳性或非特异性的可能。

本研究采用液相色谱-四级杆飞行时间质谱（liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry，LC-QTOF/MS）联用的代谢组学方法分析早期冠状动脉粥样硬化患者和对照者血浆代谢物差异，结合模式识别方法，寻找与早期冠状动脉粥样硬化病变密切相关的潜在生物标志物。

1 资料与方法

1.1 对象及分组

选取2012 年8 月至2014 年7 月在哈尔滨医科大学附属第二医院心内科住院并行冠状动脉造影术且定量分析（QCA）测定狭窄度<50%的患者。排除心肌梗死患者；曾做过经皮冠状动脉介入治疗或冠状动脉旁路移植术的患者；合并重度心力衰竭伴超声心动图左心室射血分数<30%的患者；明确诊断有糖尿病、甲状腺功能亢进等代谢性疾病的患者；伴有严重肝肾功能不全的患者；患有恶性肿瘤、自身免疫性疾病、血液系统疾病、严重感染性疾病或多器官功能衰竭的患者；妊娠期或哺乳期女性。进一步根据冠状动脉造影结果将符合上述要求的120例研究对象分为：对照组（冠状动脉造影未发现任何可辨认的斑块或狭窄）60 例和早期冠状动脉粥样硬化组（QCA 测定冠状动脉狭窄<50%）60 例。本研究经哈尔滨医科大学附属第二医院伦理委员会批准，所有血液样本的采集和临床资料的收集均获得受试者本人知情同意。

1.2 样品采集与制备

所有研究对象于入院后第2 日清晨空腹采集肘静脉血3 ml，加入乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝采血管中，以3 000 r/min 离心10 min，吸取上清液（血浆）分装后，立即放入-80 ℃冰箱内保存备用。

进样前，将血浆样品从-80 ℃冰箱中取出，于4 ℃条件下解冻。取100 μl 置于2 ml 离心管中，加入500 μl 乙腈溶液，充分涡旋2 min 后，于4 ℃下以14 000 r/min 离心15 min，取上清液于真空离心浓缩仪中抽干。残留物以100 μl 75%乙腈溶液复溶，涡旋混匀1 min 后，于4℃，14 000 r/min 离心15 min，吸取上清液至进样瓶中待测。

1.3 液相色谱分离条件

血浆样本中代谢物的分离是在1260 型液相色谱仪（Agilent 公司，美国）上采用二元溶剂梯度洗脱方式完成。色谱柱为ZORBAX SB-C18（100 mm×3.0 mm，1.8 μm）；流动相A 为含0.1%甲酸的水溶液，流动相B 为含0.1%甲酸的乙腈溶液；梯度洗脱程序如下：0～18.0 min，5%～98%流动相B；18.0～21.0 min，98%流 动 相B；21.0～21.1 min，98%～5%流 动 相B；21.1～28.0 min，5%流动相B；流动相流速为0.5 ml/min；柱温维持在40℃；进样量为10 μl。

1.4 QTOF/MS 质谱分析条件

样品经LC 分离后不分流直接注入Agilent 6530四级杆飞行时间质谱仪中，分别在电喷雾离子源的正离子模式（ESI+）和负离子模式（ESI-）下进行代谢轮廓分析。相关参数设置如下：脱溶剂气温度为350 ℃；脱溶剂气流量为10 L/min；碎裂电压为110 V；毛细管电压分别为+4 000 V/-3 500 V；以一级质谱全扫描（MS）模式对质荷比（m/z）范围50～1 000 内的所有数据进行采集，扫描频率为0.5 s。为了对代谢物进行鉴定，采用二级质谱（MS/MS）扫描方式获得质谱碎片信息，高纯氮气作为碰撞气体，碰撞能量分别设为10 V、20 V、40 V。

1.5 数据预处理

将检测得到的原始数据通过Agilent 自带的MassHunter Qualitative Analysis 软件转换为mzdata 格式，然后导入到R 语言XCMS 程序包中进行保留时间校正、峰识别、峰匹配、峰对齐和滤噪等过程，其中相关参数设置如下：method=“centWave”，peakwidth=c（10，50），其余参数采用默认值，最终得到一个包含质荷比、保留时间与峰强度的数据矩阵。进一步对所得数据进行归一化处理，即将每个离子的峰强度除以该样品中所有离子峰强度之和。

1.6 统计学分析与差异代谢物的筛选

将上述归一化后的数据导入SIMCA-P 11.5 软件中进行偏最小二乘判别分析（partial least-squares discriminant analysis，PLS-DA），获得变量重要性投影（variable importance in the projection，VIP）值，用于寻找与疾病相关的差异代谢物。进一步采用SPSS 22.0 软件进行单变量统计分析（Kruskal-Wallis 检验），得到组间有差异的代谢物（P<0.05）。将同时满足VIP>1 和P<0.05 的变量筛选为最终的差异代谢物。为了排除PLS-DA 模型存在过拟合的危险，本研究采用随机置换检验（经100 次置换）考察建立模型的有效性。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者的基本情况比较（表1）

表1 两组患者的基本情况（±s）

表1 两组患者的基本情况（±s）

注：-：无

早期冠状动脉粥样硬化组的男性为37 例，女性为23 例，平均年龄为（58.43 ± 9.69）岁；而对照组的男性为29例，女性为31例，平均年龄则为（55.88 ± 9.50）岁。经比较分析可得，两组患者在年龄、性别上的差异无统计学意义。此外，除了载脂蛋白A在两组间差异有统计学意义外，其它各项指标在组间差异均无统计学意义。由于选择试验对象的条件限制，所有早期冠状动脉粥样硬化组患者为冠状动脉造影显示至少一支主支冠状动脉管腔直径狭窄<50%者，其平均狭窄程度为（36.53 ± 12.82）%，而对照组全部患者为经冠状动脉造影确认冠状动脉管腔未发现任何可辨认斑块或狭窄者。

2.2 血浆样品代谢轮廓分析

通过LC-QTOF/MS 平台获得早期冠状动脉粥样硬化组及对照组的血浆样品总离子流色谱图，如图1 所示。早期冠状动脉粥样硬化组和对照组的总离子流图中的谱峰大体上是一致的，无法直接从谱图上观察出两组的差异，说明两组间可能存在复杂、微弱的变化，因此需要采用统计分析和模式识别方法进一步挖掘出组间的差异和其中潜在的生物标志物。经XCMS 软件对图谱数据进行预处理后，正、负离子模式下分别得到3 892 个和2 936 个变量。

图1 两组患者血浆样本的总离子流色谱图

为了探讨早期冠状动脉粥样硬化患者和对照者之间的血浆代谢差异，找到与冠状动脉粥样硬化发生密切相关的生物标志物，本研究对早期冠状动脉粥样硬化组和对照组样本进行PLS-DA 分析，结果如图2A 和2B 所示，在正、负离子模式下，早期冠状动脉粥样硬化组和对照组血浆样本几乎完全分开，说明两组患者体内的代谢模式明显不同。ESI+和ESI-对应的模型质量参数分别为：R2X=0.178，R2Y=0.933，Q2=0.540 和R2X=0.168，R2Y=0.943，Q2=0.356。从上述参数可以看出本研究建立的模型具有较高的可靠性。置换检验结果（图2C，2D）亦证实了PLS-DA 模型的有效性。

图2 早期冠状动脉粥样硬化组和对照组血浆代谢轮廓的PLS-DA 得分图和置换验证图

2.3 潜在生物标志物的筛选与鉴定

依据1.6 所述方法进行早期冠状动脉粥样硬化潜在生物标志物的筛选，最终在正、负离子模式下分别筛选鉴定出20 个和22 个潜在生物标志物，结果详见表2。两组间差异代谢物的变化情况采用变异倍数（Fold change，FC）表示，FC 值为归一化的数据在两组之间的比值（早期冠状动脉粥样硬化组/对照组）的对数（以2 为底数），正值代表代谢物相对含量升高；负值代表代谢物相对含量降低。与对照组相比，早期冠状动脉粥样硬化组患者血浆样本中磷脂酰胆碱（PC）（14:0/14:0）、植物鞘氨醇、鞘氨醇、甘油单酯（MG）（18:2）、MG（18:3）、MG（18:1）、二十二碳六烯酸、7，10，13，16，19-二十二碳五烯酸、二十碳三烯酸、亚油酸、亚麻酸、十五烷酸、反油酸、肉豆蔻酸、Δ2-反式-十六碳烯酸、棕榈酸、二十碳二烯酸、3-羟基癸酸、3-（3-羟基苯基）丙酸、对甲苯基硫酸、吲哚酚硫酸、月桂酰基乙酸、十六碳二烯酸和癸酰乙酸这24 种代谢物含量显著升高，而溶血磷脂酰胆碱（LysoPC）（18:1）、LysoPC[18:4（6Z，9Z，12Z，15Z）]、LysoPC（20:4）、LysoPC（16:0）、LysoPC（15:0）、LysoPC[22:4（7Z，10Z，13Z，16Z）]、LysoPC[18:2（9Z，12Z）]、LysoPC（18:1）、LysoPC[22:6（4Z，7Z，10Z，13Z，16Z，19Z）]、溶血磷脂酰乙醇胺（LysoPE）（18:2）、磷脂酰乙醇胺（PE）（16:0/0:0）、PE（P-16:0/0:0）、PE（42:8）、磷脂酰甘油（PG）（18:0/0:0）、甘油二酯（DG）（36:3）、DG（38:5）、硫酸普拉睾酮和L-岩藻糖 18 种物质含量明显降低。

表2 潜在生物标志物信息

3 讨论

本研究共筛选鉴定出42 个潜在生物标志物，其中包括了一些磷脂类物质，如LysoPC 和LysoPE等。它们在早期冠状动脉粥样硬化患者血浆中的含量相比于对照者发生了明显的变化，且大部分物质呈下降趋势。磷脂不仅种类繁多，而且彼此之间可以相互转化。其中，PC 和PE 可通过胞二磷-胆碱（CDP-胆碱）途径合成，两者之间还可以相互转化，并且两类物质在磷酸酶A2 的水解作用下，分别生成LysoPCs 和LysoPEs。有研究表明，LysoPC和LysoPE 类物质有助于抑制巨噬细胞的合成，阻止巨噬细胞的泡沫化，从而减少胆固醇的积累和动脉粥样硬化的发生[8]。此外，近期一项临床试验发现，LysoPC 可降低冠心病的风险性[9]。而我们的研究结果亦证实了这些发现。

本代谢组学研究显示，MG（18:2）、MG（18:3）和MG（18:1）三种甘油单酯在早期冠状动脉粥样硬化患者血浆中的含量显著上调，而DG（36:3）和DG（38:5）两种甘油二酯类物质在早期冠状动脉粥样硬化组中呈明显下降趋势。甘油单酯和甘油二酯均参与了甘油糖脂代谢，这说明早期冠状动脉粥样硬化患者体内发生了甘油糖脂代谢的紊乱。人体内DGs 的生成主要通过以下3 种途径：（1）从头合成途径：主要是由磷脂酸在磷酸酶的作用下脱磷酸形成的；（2）由甘油三酯降解生成，该途径主要受甘油三酯酯酶（ATGL）和激素敏感性脂肪酶（HSL）的作用；（3）通过甘油单酯途径合成，该过程主要由MG酰基转移酶调控。而存在的DGs 一方面可以在DG酰基转移酶的催化下转化为甘油三酯；另一方面，可以降解生成甘油单酯和游离脂肪酸。由此可见，DGs 和MGs 在甘油三酯的合成和分解中起着核心作用。近期一项大规模随机临床研究证明，DGs 和MGs 是冠心病的致病因素[10]。而MGs 在甘油二酯酯酶和HSL 的催化作用下，由DGs 分解生成。进一步可在甘油单酯酯酶的作用下，降解生成甘油和游离脂肪酸。因此，DGs 和MGs 代谢紊乱可能导致游离脂肪酸数量的增加。过多的游离脂肪酸可以活化JNK 通路和p38 MAP-kinase 信号通路分别引起巨噬细胞的浸润和迁移[11]。多项研究表明，巨噬细胞的浸润和迁移在动脉粥样硬化的形成和发展过程中发挥着关键作用[12]。因此，异常的DGs 和MGs，尤其是MG（18:2）和MG（18:3），应该与早期冠状动脉粥样硬化的发生密切相关。

正常情况下，心脏活动需要的能量主要来源于脂肪酸氧化过程。本研究早期冠状动脉粥样硬化组患者血浆中的一些长链脂肪酸（例如亚油酸和亚麻酸等）水平显著高于对照组，这可能由于在冠状动脉粥样硬化的条件下，心脏对氧气的需求量超过了供氧量，机体为了弥补能量供给的不足，增强了患者体内长链脂肪酸的合成，这与Zha 等[13]开展的代谢组学研究得到的结果一致，提示长链脂肪酸的代谢异常可能是触发冠状动脉粥样硬化产生的关键致病作用。

本研究发现的潜在生物标志物参与了磷脂代谢、糖脂代谢、鞘脂代谢及脂肪酸代谢，这为更加深入了解早期冠状动脉粥样硬化发生的代谢机制提供了新的信息。后续对这些代谢物及其所在代谢途径进行深入的生物学研究，有望揭示早期冠状动脉粥样硬化的发病机制，同时也可能为早期冠状动脉粥样硬化的治疗或干预提供新方向。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突