BthC2c1系统剪切基因的初步研究

吴 丹，初文竹，邱羽菲，潘 宇，曹志琴1，，史嘉翊1，

(1.佳木斯大学基础医学院,黑龙江 佳木斯 154007；2.牡丹江医学院；3.牡丹江市第二人民医院消化内科,黑龙江 牡丹江157011)

有规则的簇生间隔短回文重复(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR)-Cas systems是一种细菌和古细菌的防御系统,可以用于抵抗噬菌体入侵DNA[1-2]。CRISPR-Cas系统由两个关键的部分组成，其可以对噬菌体和质粒进行免疫，一种为效应模块，它可以将遗传物质送入CRISPR阵列生成CRISPR RNAs(crRNAs)，另一种适和效应模块在crRNA的引导下，可以靶向并切割入侵的核酸[3-5]。

Cas9是一个分子量较大的多区域核酸酶，它可以通过识别目标DNA上的前间区序列邻近基序(Protospacer adjacent motif，PAM)序列，极保守的识别并裂解目标DNA[6-8]。C2c1在是CRISPR-Cas系统中的V-B亚型。C2c1可以通过双RNA引导的DNA内切酶，具有双链DNA切割活性。生物化学研究表明，与最小的78 nt tracrRNA结合的crRNA或一个融合的sgRNA都足以使C2c1介导的DNA裂解。一个14nt直接重复序列(direct Repeat，DR)与tracrRNA杂交形成一个crRNA:tracrRNA双链，然后装载到C2c1上，引导识别和切割DNA。C2c1通过识别原间隔序列50末端富含t(T-rich)的PAM，介导DNA干扰，并且C2c1已被证明在人细胞裂解液中具有内切酶活性[9]。

本研究在前期研究[10]基础上对BthC2c1的基因剪切能力进行了评估，以期为改造开发新的基因编辑工具奠定基础。

1 材料方法

1.1 材料BthC2c1蛋白(前期表达纯化),293T人肾上皮细胞与DF-1鸡成纤维细胞及实验所用表达载体(医药研究中心所有)，本研究所用小鼠为DBF1小鼠。

1.2 主要试剂及仪器酵母提取物、蛋白胨(Oxoid)；基因组提取试剂盒(康为世纪)，NaCl(Solarbio)；咪唑(Solarbio)；IPTG(biofroxx)；PMSF(Ther-mo Scientific);Ni-NTA Agarose(上海凯杰生物)；胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM(Hy-Clone)、蛋白分子量Marker(Bio-rad);凝胶成像系统G-BOX Chemi XR5(Gene Company Limited)；细胞恒温CO2培养箱(SANYO)；蛋白电泳装置(Bio-rad)；离心机(Thermo)。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养 从液氮中取出冻存细胞，37 ℃水浴约2 min，迅速解冻细胞。以下操作皆在超净台中进行：将3 mL含10%胎牛血清的DMEM培养基加入细胞中；低速离心5 min后弃培养基，再加入4 mL含10%胎牛血清的DMEM培养基，重悬细胞后接于含有10%胎牛血清的DMEM生长培养基的培养皿中，均匀摇晃后于饱和水分的37 ℃，5% CO2的细胞培养箱中进行培养。培养至细胞密度至70%～80%，在37 ℃下用0.25%的胰酶消化1 min，而后加入4 mL的含10%胎牛血清的DMEM来终止消化。重悬后稀释到新的含10%胎牛血清的DMEM培养皿中，及时更换培养基。

1.3.2 细胞转染 选择两种细胞系进行细胞转染，分别为人肾上皮细胞293T细胞和鸡成纤维细胞DF-1。人源细胞选择了EMX1基因，鸡源细胞选择了MSTN，在所选基因上选择合适的靶点，根据靶点序列设计人工合成5′端带有不同酶切位点识别序列的靶序列寡核苷酸引物，通过PCR对引物直接退火，合成出携带不同的黏性末端的靶序列DNA短片段，将其插入到载体pU6-BtsgRNA上，转染所用BthC2c1蛋白表达载体为BthC2c1-NLS-Flag/PCDNA3.4,转染实验中选择Cas9作为对照，转染时具体所转质粒及转染顺序见表1、表2。具体实验方法如下:以人肾上皮细胞293T为例，将CRISPR蛋白质粒与含有相应sgRNA的质粒转染进入已经铺好293T细胞的12孔板，细胞浓度2×105/孔。设置阳性对照，阴性对照(转染蛋白质粒同时转染不含有sgRNA的空载体质粒)，转染48～72 h。具体操作如下:(1)DNA 1.5 μg加无抗opti-MEM定容至100 μL；(2)lipo2000 5 μL加无抗opti-MEM定容至100 μL,5 min室温静置；(3)混匀步骤1和步骤2中的样品，室温放置30 min；(4)将孔中的培养基吸出，换成不含有胎牛血清或抗生素的DMEM/opti-MEM 150 μL；(5)将步骤3混匀的样品加入孔中，轻转摇匀，置于37 ℃培养箱；(6)4 h后，将无抗培养基吸出，每孔加入含10%胎牛血清的DMEM培养基1 mL。

表1 293T细胞转染所用质粒

表2 DF-1细胞转染所用质粒

1.3.3 小鼠胚胎的获取

1.3.3.1 超数排卵 (1)取健康、活泼的DBF1雌鼠，每只注射5 IU PMSG；(2)48 h后每只再注射5 IU hCG，注射后使其与活泼、健康的DBF1雄性小鼠交配过夜；(3)交配后次日，将检测阴道栓后标记小鼠。

1.3.3.2 受精卵的收集 (1)提前将M16、M2培养基和石蜡油37 ℃预热；(2)在交配次日早上将标记过的母鼠引颈处死，挑取输卵管部位放入M2培养基中；(3)将成团的受精卵移至1%透明质酸酶中消化1～2 min；(4)将单个的受精卵移至预热M2中，清洗3～5次；(5)将受精卵移入M16培养基中，至于37 ℃，5% CO2培养箱中约3 h，培养至原核清晰后进行显微注射。

1.3.4 T7E1实验检测酶切活性

1.3.4.1 细胞酶切活性检测实验 将转染后的细胞进行收集。细胞全基因组利用柱式基因组提取试剂盒来提取。以提取的全基因组为模板进行PCR扩增含有所选基因切割靶点的序列。PCR产物采用1%琼脂糖凝胶电泳。靶点片段胶回收。37 ℃ T7E1酶切反应20～45 min，每个样品均平行退火两管，一管在退火后加入T7E1酶(标示为1～8)，另一管不加T7E1酶作为对照(标示为C1～C8)，酶切产物加10 μL 2×RNA loading，5%尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果。

1.3.4.2 小鼠胚胎酶切活性检测实验 SpyCas9为对照。首先根据小鼠EMX1基因设计两条BthC2c1的sgRNA，命名为Bth-EMX1-1、Bth-EMX1-2，根据小鼠Kdm2b基因设计SpyCas9的sgRNA，命名为Spy-Kdm2b-9，将sgRNA体外转录并纯化出来。作为对照试验，纯化BthC2c1野生型蛋白及SpyCas9野生型蛋白，先在体外进行酶切验证。然后将BthC2c1、SpyCas9蛋白与相应的sgRNA混合，通过凝胶过滤层析装配为蛋白-sgRNA复合物，通过超数排卵，将复合物通过显微注射进入小鼠胚胎中，培养72 h后裂解，通过T7E1实验观察BthC2c1的酶切活性。BthC2c1在小鼠胚胎内的酶切活性通过T7E1法来进行检测。在对靶片段进行退火时，每个样品均平行退火两管，一管在退火后加入T7E1酶(标示为1、2、9)，另一管不加T7E1酶作为对照(标示为C1、C2、C9)。

2 结果

2.1 人肾上皮细胞293T细胞由图1所示:在293T细胞中，Cas9对EMX1基因有明显的切割，而BthC2c1对于EMX1基因的切割并不明显，未见明显条带。

图1 BthC2c1在293T细胞中酶切活性检测结果

2.2 鸡成纤维细胞DF-1细胞由图2结果显示:在DF-1细胞中，Cas9在guide2 sgRNA介导下对MSTN基因有明显的切割，而BthC2c1对于MSTN基因的切割并不明显，未见明显条带。

图2 BthC2c1在DF-1细胞中酶切活性检测

2.3 小鼠胚胎sgRNA体外检测结果图3结果显示:BthC2c1的两条sgRNA均可以介导蛋白剪切底物DNA，SpyCas9的sgRNA也可以介导蛋白剪切底物。

图3 BthC2c1和SpyCas9体外酶切活性检测

2.4 小鼠胚胎内检测结果在小鼠胚胎内的酶切活性检测结果表明:SpyCas9可以在sgRNA的介导下剪切靶基因片段，电泳后可以看到清晰的酶切产物两条条带，而BthC2c1对靶基因片段剪切不明显(图4)。

图4 BthC2c1在小鼠胚胎中酶切活性检测

3 讨论

CRISPR-Cas系统是近年来热门的基因编辑技术。C2c1作为更小分子，脱靶效应更低和识别要求更高等特点的一类编辑系统有着广阔的应用前景。现阶段科研人员已完成了对C2c1系统结构的解析。通过改造CRISPR-C2c1系统也获得了多种可以用于基因编辑的工具。Teng等开发的AaC2c1能够有效地在小鼠胚胎中引入有针对性插入缺失的突变，并成功地将种系其传递给下一代，且与在细胞系和小鼠中都均未发现脱靶效应[11]。而后又开发了AmC2c1、BhC2c1、Bs3C2c1和LsC2c1四种CRISPR-C2c1系统可以对人类基因组进行编辑，使用多个sgRNAs可以精确的同时编辑人类基因组中的多个位点[12]。Jonathan等通过突变BhC2c1，得到BhC2c1 v4可以促进了人类细胞系和原代人T细胞的体外基因组编辑，同时也发现其相比Cas9具有更高的特异性和更低的脱靶效应[13]。WuF使用CRISPR-C2c1系统对拟南芥进行了基因编辑，成功实现了多重基因组编辑和大片段的基因敲除[14]。而后紧接着Wang使用CRISPR-C2c1系统在棉花中成功进行了基因编辑，并且在基因测序后未发现脱靶效应[15]。

前期研究发现发现，BthC2c1剪切DNA的产物会产生黏性末端，断裂位点远离PAM，与Cpf1相似，却与Cas9剪切靶DNA位点邻近PAM不同。同时，Cas9、NHEJ修复时会导致碱基插入或缺失，使得PAM邻近序列被更改，使Cas9无法再次识别和剪切靶DNA。而BthC2c1和Cpf1剪切DNA位点远离PAM，NHEJ修复不会改变PAM邻近序列，仍可识别和切割靶基因，使得基因编辑效率得到提高。此外，Cas9与Cpf1剪切靶DNA的断裂位点都位于介导RNA-靶DNA异源双链以内，而BthC2c1剪切靶DNA时断裂位点位于异源双链以外，对异源双链影响很小，这种稳定的剪切模式可能还适用于对同一特定位点进行多次剪辑[10]。

基于之前研究对CRISPR-C2c1编辑系统BthC2c1的结构和作用原理的解析，本研究进一步探讨了CRISPR-C2c1编辑系统的基因剪切能力。两种细胞中Spcas9可以通过T7E1实验检测到底物剪切，Bthc2c1剪切不明显；为小鼠胚胎设计的Spycas9-sgRNA和Bthc2c1-sgRNA在体外均可以剪切底物，在体内Spycas9系统可以检测到剪切，Bthc2c1剪切不明显。温度可能会影响BthC2c1在动物细胞基因编辑功能，前期研究发现42 ℃时BthC2c1具有更好的酶切效率，或许对于耐热植物会有很好的编辑优势，所以接下来尝试在一些耐热植物中进行编辑效率的评估。基于结构信息，可以对BthC2c1系统进行改造，以扩大其编辑的应用范围。由于BthC2c1的剪切能力依赖于温度，温度可能作为启动基因编辑的开关，通过温度变化来进行基因编辑的动态控制，可能成为一种新的基因编辑控制工具，提供基因编辑新的思路。