MST1与LATS1/2在年龄相关性白内障中的表达及相关性

陈晓亚,刘善贺,胡玉珠,张高波,崔亭松,胡姗姗

(1.牡丹江医学院；2.牡丹江医学院附属红旗医院眼科，黑龙江 牡丹江 157011)

年龄相关性白内障(Age-related-cataract，ARC)是晶状体老化后的退行性改变，年龄、性别、外伤、氧化、辐射照射、酒精等均可以导致其发生[1]。ARC的发生是导致视力下降的主要原因,在全球范围内致盲性眼病中排首位。因此，深入研究并阐明ARC发生、发展过程中的具体分子机制，找到发病原因具有重要的理论和现实意义。

哺乳动物STE20样激酶(Mammalian Ste20-likeprotein kinase，MST1)是人体普遍表达的一种丝/苏氨酸蛋白激酶，主要表达于免疫细胞，参与细胞存活、迁移、增殖、分化、凋亡和免疫应答[2]。据报道，MST1在体外诱导线粒体应激致视网膜色素上皮细胞凋亡中发挥着关键作用[3],但MST1在晶状体上皮细胞(Lens epithelial cells,LECs)的表达情况以及是否参与ARC的发生尚未有文献报道。大肿瘤抑制激酶1/2(Large tumor suppressor kinase1/2，LATS1/2)是一种抑癌基因，可转录翻译丝/苏氨酸激酶，具有高度保守特征，在细胞增殖、凋亡、迁移、转录调控和维持基因稳定性等方面发挥着重要作用[4-5]。研究表明，LATS1/2参与Hippo通路并且 受MST1的调控，Hippo通路可调控细胞增殖、分化、凋亡等以及介导体内多种疾病的发生发展，在眼科领域中也起着重要的调控作用[6]。然而，LATS1/2否参与ARC的发生尚未有文献报道。ARC作为一种最常见的眼部衰老性疾病，对其细胞凋亡的机制研究则更为重要。

本研究目的是通过观察MST1及LATS1/2在正常人和ARC患者晶状体上皮细胞中的蛋白表达水平的差异，为ARC的发病机制以及预防和治疗提供理论依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象收集于2020年12月至2022年6月期间在牡丹江医学院附属红旗医院就诊并行白内障超声乳化手术的年龄相关性白内障患者共20例，为ARC组。纳入标准:ARC组为皮质性白内障患者年龄在50～70岁，无高血压、糖尿病、角膜或视网膜疾病，无眼部外伤或眼内手术史。正常组为同期眼外伤发生晶状体脱出的患者15例，年龄50～70岁，无高血压、糖尿病、角膜或视网膜疾病。本研究收集的临床样本均经医院伦理委员会批准，并在患者知情同意的情况下签署同意书。

1.2 组织的收集ARC组样本的收集均由同一眼科医生在行白内障超声乳化手术中撕除晶状体前囊膜时获取，正常组样本的收集均由同一眼科医生在行晶状体摘除术中撕除晶状体前囊膜时获取。将所得组织一分为二，一半置于4%的多聚甲醛组织固定液中浸泡，常温放置，用于免疫组织化学染色；另一半置于液氮罐中冷冻，并转移至-80 ℃的冰箱中保存，用于western blot实验操作。

1.3 试剂兔抗MST1一抗、兔抗LAST1/2一抗购自美国Abcam公司、辣根酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)二抗、DAB显色试剂盒购自北京中衫生物公司。

1.4 免疫组织化学染色

1.4.1 实验步骤 术后组织标本采用4%甲醛固定，经石蜡包埋、切片等处理，进行染色步骤。切片于65 ℃恒温箱下烘烤2 h以上，进行二甲苯及梯度酒精脱蜡、柠檬酸钠煮沸15 min抗原修复操作、3%过氧化氢室温避光孵育10 min。PBS冲洗，重复3次，滴加FBS，室温孵育30 min后，甩去多余液体。滴加一抗(1∶50)，4 ℃冰箱保存过夜。每张组织切片用PBS清洗，滴加二抗，37 ℃温箱中孵育30 min，后PBS冲洗，DAB试剂显色5 min，盐酸乙醇及蒸馏水洗片，梯度酒精及二甲苯脱水，中性树脂封片，正置显微镜观察。

1.4.2 染色结果判定 染色结果由两位实验人员双盲法观察判定，采用半定量分析法计分。每张切片随机选取5个高倍视野(×200)，每个视野计数50个细胞，计算阳性细胞所占百分比，取平均值，阳性细胞百分比<10%为0分,10%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。按照染色强度进行评分:无显色为0分,淡黄色为1分,棕黄色为2分，棕褐色为3分，将阳性细胞百分比评分与染色强度评分相乘，0～1分为(-)，2～4分为(+)，5～8分为(++)，9～12分为(+++)；(+)～(+++)者为阳性表达。

1.5 Western blot用含有蛋白酶、磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液裂解组织，离心、取上清，提取组织蛋白。BCA蛋白浓度测定试剂盒检测组织蛋白浓度，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，然后将蛋白转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脱脂牛奶37 ℃封闭1 h。加入一抗(1∶500)，4 ℃冰箱孵育并过夜。洗膜后，加入二抗(1∶3 000)，轻吹混匀，室温摇床1 h。加化学发光试剂避光显影，曝光拍照，ImageJ软件分析扫描结果。

1.6 统计分析所有统计数据均采用SPSS 25.0软件进行统计学分析，计数资料以频数和百分比表示n(%)，组间比较采用卡方检验，双向有序变量的相关性采用Kendall相关分析，以P<0.05时，差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ARC患者的晶状体上皮细胞中MST1蛋白表达水平升高免疫组化显示，ARC组LECs的阳性表达率为90.0%，而正常组的阳性表达率为53.3%，两组表达差异具有统计学意义(χ2=17.64，P<0.01)(图1A、表1)。此外，Western blot显示，与正常组相比，ARC组晶状体上皮细胞中的MST1表达水平升高(图1B)。

表1 免疫组化中MST1蛋白的表达水平比较

图1 MST1基因的蛋白水平的在年龄相关性白内障中呈现高表达

2.2 ARC患者的晶状体上皮细胞中LATS1/2蛋白表达水平升高免疫组化显示,ARC组LECs的阳性表达率为85.0%,而正常组的阳性表达率为46.7%，两组表达差异具有统计学意义(χ2=15.36，P<0.01)(图2A、表2)。此外,Western blot显示ARC组晶状体上皮细胞中LATS1/2的蛋白水平升高(图2B)。

表2 免疫组化中LATS1/2蛋白的表达水平比较

图2 LATS1/2基因的蛋白水平的在年龄相关性白内障中呈现高表达

2.3 ARC患者中MST1和LATS1/2的相关性分析Kendall等级相关检验显示，MST1与LATS1/2在ARC表达中呈中度正相关(Kendall’s tau-b=0.438)，具有统计学差异(P<0.05)，见表3。

表3 MST1和LATS1/2在ARC中的相关阳性表达

3 讨论

ARC又称老年性白内障，是最为常见的白内障类型，我国每年新增数十至数百万的白内障患者。随着社会老龄化的加速，ARC发病率也将进一步增长。目前来看，手术仍是治疗白内障最有效的方法，尽管白内障手术被认为是非常成功的，但手术相关的并发症不可避免地会导致不可逆的失明，因此白内障仍然是一个巨大的全球健康负担[7-8]。目前，ARC确切病因尚未完全研究清楚，一般认为年龄、性别、职业、放射(可见光，紫外线，X线等)、氧化、物理损伤、饮食和用药等均是其危险因素[9]。近年来的研究表明，晶状体上皮细胞凋亡是白内障形成的共同细胞基础，而H2O2产生的氧化自由基可引起晶状体上皮细胞凋亡[10]。因此，氧化应激所诱导的细胞凋亡机制越来越引起学者的广泛关注。

MST1最初于酵母细胞中得到鉴定，果蝇模型实验结果表明MST1参与HIPPO-LATS-YORK-IE信号通路并与肿瘤发生密切相关[11]。而Hippo信号通路是体内参与调控器官生长发育、增殖凋亡、调节器官大小体积平衡的重要的生长控制信号通路[12]。因此，MST1作为Hippo信号通路的核心组件，通过磷酸化、二聚化以及核内外定位等方式，在细胞分化、控制稳态、促进细胞黏附和迁移、抑制自噬、促进凋亡等多种生理活动中发挥重要作用[13]。Wei等人[3]研究发现MST1在体外诱导线粒体应激致视网膜色素上皮细胞凋亡中发挥着关键作用。ARC作为人类一种最常见的眼部衰老性疾病，而MST1作为细胞增殖及凋亡影响较大的一类指标，推测其可能与ARC的发病机制相关。多种研究表明，LATS1/2也是Hippo信号通路核心组件之一，受MST1的调控。在外来刺激下，MST1/2可被激活，发生磷酸化，随后激活LATS1/2，而后激活Yap磷酸化(Yap-ser127)，至使磷酸化Yap滞留在细胞质内无法进入核内产生效应，最终泛素化降解。这一过程阻断了Hippo反应基因的表达，从而抑制细胞增殖，促使细胞凋亡[14-15]。因此，LATS1/2是否通过MST1/2的调控参与Hippo信号通路介导ARC的发生有待进一步研究。

综上所述,本研究的结果显示,MST1和LATS1/2的蛋白水平在ARC患者晶状体上皮细胞中呈现高表达，Kendall等级相关分析得出，MST1与LATS1/2的表达具有正相关性，提示两者在ARC的发展中具有协同关系，并且大量文献也表明MST1可以调控LATS1/2参与疾病的发生。通过以上研究论述，我们发现了ARC患者晶状体上皮细胞中MST1和LATS1/2的表达，为进一步研究ARC的发病机制以及预防和治疗提供了新的方向。