新疆部分地区临床型乳房炎源大肠杆菌的调查分析

常军帅，张琪，林津如，屈勇刚，梁晏，李娜，党瑞莹，王紫阳

（1.石河子大学动物科技学院，石河子 832003；2.动物疾病防控兵团重点实验室，石河子 832003）

奶牛养殖业是新疆的一个支柱性产业，奶牛乳房炎（Bovine mastitis）对该区奶业的经济效益产生了一定的影响。据调查发现，全世界约1/3的奶牛患有不同类型的乳房炎，我国部分养殖场超过50%的奶牛患有乳房炎，损失巨大[1,2]。大肠杆菌是引起奶牛乳房炎的常见病原菌之一，占总发病率的17.6%～34.5%[3,4]。市场上虽有大肠杆菌亚单位疫苗，但因大肠杆菌血清型多，暂未能取得理想的预防效果，目前仍以抗生素治疗作为治疗乳房炎的主要手段。抗生素在生产中的不合理使用，导致了大肠杆菌的耐药机制呈现出了多元化。Tomazi等[5]发现巴西276株牛源大肠杆菌对红霉素、苯唑西林、青霉素等耐药率超过了70%；张亚茹[6]对甘肃地区41份牛源大肠杆菌进行药敏试验，发现对利福平、克林霉素和万古霉素的耐药率超过了90%。引发奶牛乳房炎的大肠杆菌都具有一定的致病性，致病性通常与毒力基因呈正相关，大肠杆菌毒力基因的相关毒力因子主要包括黏附素、肠毒素、志贺毒素、毒力岛ETT2等。张艳等[2]用0.5mL的奶牛乳房炎源大肠杆菌以1×108CFU/mL的浓度对小鼠进行致病性试验，发现攻毒组小鼠的心脏、肝脏明显肿大；高娃等[7]用大肠杆菌对小鼠进行攻毒试验，发现4h内小鼠便可死亡。因此，对乳房炎奶样中大肠杆菌进行分离鉴定、生化试验、药敏试验、毒力基因检测及小鼠致病性试验，可为大肠杆菌的流行病学调查提供参考，也可指导治疗临床型乳房炎时药物的合理使用。为此，笔者团队对新疆部分地区临床型乳房炎源大肠杆菌的感染率、耐药情况及致病情况进行了调查分析。

1 材料

1.1 试剂与药品

奶牛乳房炎快速诊断试剂（PH2004111），购自生泰尔（内蒙古）科技有限公司；LB肉汤培养基，购自生工生物工程（上海）股份有限公司；麦康凯、伊红美蓝等试剂，细菌微量生化反应管，购自青岛海博生物科技有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司；头孢哌酮（CFP,75μ g/片）、头孢曲松（CRO,30μ g/片）、红霉素（ERY,15μg/片）、阿米卡星（AMK,30μ g/片）、庆大霉素（GEN,10μ g/片）、强力霉素（DO,30μg/片）、恩诺沙星（ENR,10μ g/片）、氯霉素（CHL,30μg/片）、万古霉素（VAN,30μ g/片）、复方新诺明（STX,1.25/23.75μg/片）、呋喃唑酮（FR,300μg/片）等药敏纸片，购自杭州微生物试剂有限公司。

1.2 试验动物

6周龄SPF级小鼠24只（不分雌雄），体重约20g，购自新疆医科大学医学实验动物中心。

1.3 主要仪器

体细胞检测仪，购自华诚睿光（中国）生物科技有限公司；超净工作台，购自上海鸿都电子科技有限公司；DHP-9082电热恒温培养箱，购自上海精宏实验设备有限公司；PCR仪，购自美国赛默飞世尔科技有限公司。

2 方法

2.1 乳样的采集

根据临床表现，对乳房红肿、乳样异常的奶样进行加州乳房炎测试法（CMT）检测，并用体细胞计数（SCC）仪进行复检，判定标准参考相关文献[8]，若两种检测方法有所误差，需重新检测，并以SCC结果为准。对确诊乳区的奶样，无菌采集，4℃保存。

2.2 大肠杆菌的分离纯化

无菌操作，用灭菌棉签蘸取奶样四区划线于LB肉汤琼脂平板上，倒置放于37℃电热恒温培养箱培养24h后观察菌落形态。挑取典型的大肠杆菌单菌落，再次四区划线于LB肉汤琼脂平板上。反复操作3次以上，直到单个菌落区上的每个菌落大小、形状、颜色一致，于载玻片上干燥固定，革兰氏染色后，油镜下观察形态、纯度及染色特征。

纯化好的细菌用无菌接种环四区划线于麦康凯琼脂平板上，倒置放于37℃电热恒温培养箱培养24h后观察菌落形态。用灭菌接种环挑取粉红色湿润菌落四区划线于伊红美蓝琼脂平板上，菌落带有金属光泽的初步判定为大肠杆菌，再进一步进行三糖铁试验。

2.3 大肠杆菌的生化试验

按说明书进行无菌操作，取纯化好的菌液进行大肠杆菌微量生化反应试验，置于灭菌容器内，放37℃恒温培养箱，18～24h后观察记录结果。

2.4 大肠杆菌的PCR鉴定

按照天根细菌DNA基因组提取试剂盒的操作说明，提取的细菌DNA可直接用于PCR扩增。引物序列参考文献[9]，由北京睿博兴科生物技术有限公司合成大肠杆菌特异性引物,引物序列为：F：5'-GGTAACGTTTCTACCGCAGAGTTG-3'；R：5'-CAGGGTTGGTACACTGTCATTACG-3'。PCR反应体系（20μL）：2×Taq PCR Master Mix 10μL，菌液模板2μL，上、下游引物各1μL，ddH2O 6μ L。PCR反应条件：95℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。反应结束后取7μLPCR反应产物进行1%琼脂糖电泳，预期产物大小为468bp。

2.5 大肠杆菌的药敏试验

将鉴定为大肠杆菌的分离株培养至对数生长期（OD600≈0.5）。采用琼脂扩散法（K-B法）进行药物敏感试验，用无菌涂布器将200μL的纯菌液均匀涂布于LB琼脂平板上，待平板干燥后，按照两药敏纸片中心间距不小于24mm、纸片边距平皿大于15mm的原则贴药敏纸片于琼脂平板的表面，倒置放于37℃电热恒温培养箱培养24h后观察并测量抑菌圈直径（mm），参照美国CLSI标准进行判定[10]。

2.6 毒力基因检测

选择大肠杆菌7个毒力基因：Stx2、sep2、sta、hlyA、K99、ETT2和eaeA，引物序列参考文献[11]，由北京睿博兴科生物技术有限公司合成。按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书，对分离出的大肠杆菌进行核酸提取。PCR反应条件的退火温度依据表1，其他按照方法2.4进行。扩增产物通过1%的琼脂糖凝胶电泳后，在凝胶成像仪内观察是否出现目的条带。

表1 PCR引物信息

2.7 小鼠攻毒试验

将含多种类型毒力基因的大肠杆菌作为攻毒株，毒力基因完全一致的选一株即可，每组6只，同时设立1组健康对照组。参照有关文献[11]，将攻毒组菌液浓度定为1×108CFU/mL，腹腔注射，注射量为0.5mL/只。健康组每只小鼠腹腔注射0.5mL的PBS。注射后观察小鼠的精神状态，对死亡的小鼠进行剖检观察病变并无菌采集肝脏进行病原菌检测。同时剖检阴性小鼠，作为对比。

3 结果与分析

3.1 临床型乳房炎乳样采集结果

通过临床检查（图1A）及CMT（图1B）检测出53个乳区为临床型乳房炎，通过SCC复检（图1C）后发现有47份乳样体细胞数＞5×106个/mL，被确诊为临床型乳房炎乳样。

图1 临床型乳房炎的检测

3.2 大肠杆菌分离与鉴定结果

从4 7份样品中共分离出1 4株大肠杆菌（E1～E14），分离率为29.79%(14/47)。纯化好的大肠杆菌经革兰氏染色后，油镜下为红色杆状（图2A）。菌落在LB肉汤琼脂平板上为边缘光滑整齐、湿润、凸起的灰白色圆形菌落；在麦康凯琼脂平板上为边缘光滑整齐、粉红色、凸起的圆形菌落（图2B）；在伊红美蓝琼脂平板上为带金属光泽、凸起的紫黑色圆形菌落（图2C），在三糖铁试验中，琼脂柱变为黄色，部分有气泡产生，斜面菌落呈淡黄色（图2D）。

图2 大肠杆菌的特性

3.3 大肠杆菌生化鉴定结果

14株大肠杆菌的吲哚试验、甲基红（MR）试验、动力学试验都为阳性，VP试验、Koreser氏枸橼酸盐试验皆为阴性，对各种糖的分解略有不同，符合大肠杆菌的生化特性（图3）。

图3 部分生化试验（左为阴性对照）

3.4 大肠杆菌PCR鉴定结果

通过P C R鉴定，1 4株大肠杆菌的条带均在400～500bp之间，且与阳性对照一致，为468bp，与预期大小一致（图4）。

图4 大肠杆菌的RCR鉴定

3.5 大肠杆菌的药敏试验结果

在11种药敏试验中，14株大肠杆菌都具有多重耐药性，最少的为3重耐药，最多的为11重耐药。其中CFP、CRO、ERY、DO、ENR、CHL、FR的耐药率超过了85.71%；9重及以上耐药的菌株占总数的71.43%（10/14）。结果见表2、图5。

表2 药敏试验结果

图5 多重耐药性结果

3.6 毒力基因检测结果

本试验检测了大肠杆菌的7个毒力基因，结果显示，Stx2、hlyA、K99、ETT2和eaeA这5种毒力基因均被检测出，其中有4株菌具有多种毒力基因，占总数的28.57%。结果见表3、图6。

表3 毒力基因检出结果

图6 部分毒力基因PCR检测结果

3.7 小鼠攻毒试验结果

对小鼠进行攻毒后，小鼠精神状态逐步变差，48h内第1组死亡2只小鼠，第2组死亡3只小鼠，第3组死亡4只小鼠，健康对照组未有小鼠死亡（表4）。剖检死亡小鼠均发现：皮下充血，十二指肠肠壁变薄，肝脏有出血点；健康小鼠一切正常（图7）。无菌采集攻毒组小鼠的肝脏进行PCR鉴定，均鉴定出了大肠杆菌。

表4 小鼠致病性试验结果

图7 小鼠攻毒试验

4 讨论

本次采样季节为7月份，是环境型乳房炎高发季节，所以本次试验将大肠杆菌作为目标菌进行分离鉴定。通过常规方法分离纯化细菌后再用特异性PCR鉴定，确定出了14株大肠杆菌，分离率为29.79%（14/47），高于朱宁等[12]报道的上海地区临床型乳房炎患牛乳中大肠杆菌的分离率(15.5%)和王晓等[13]报道的某荷斯坦牛场牛奶中大肠杆菌的分离率(15.5%)，低于苑晓萌等[14]报道的成都地区牛奶中大肠杆菌的分离率（38.1%）。

经对14株大肠杆菌进行11种抗生素的药敏试验发现：对头孢哌酮和万古霉素的二重耐药率高于71.43%（10/14）；对头孢哌酮+头孢曲松+红霉素+庆大霉素+强力霉素+恩诺沙星+氯霉素+万古霉素+复方新诺明+呋喃唑酮的多重耐药，高达50.00%（7/14）。马博等[15]发现从石河子地区某规模化奶牛场分离出的大肠杆菌，对林可霉素、青霉素、杆菌肽、红霉素的耐药率都超过了90%；倪春霞等[16]发现在内蒙古、甘肃、四川和上海4地部分奶牛场中的大肠杆菌对青霉素和万古霉素有较强耐药。这说明我国大部分地区奶牛场的大肠杆菌普遍出现对青霉素的耐药现象，对其他药物的耐药现象差异较大。毒力基因检测结果显示，hlyA检出率最高，为28.57%（4/14）；ETT2的检出率只有21.43%（3/14），远低于汪强荣的检出率（95.16%），推测是由于不同地区菌株差异所导致[11]。在小鼠攻毒试验中，大肠杆菌主要造成小鼠皮下充血、十二指肠和肝脏出现病变，与高娃等[7]研究结果相同，说明菌株含毒力基因数量的增加与菌株的致病性呈正相关，增加了乳房炎的发病率。

大肠杆菌为条件性病原菌，并非不可控，所以生产中要提高饲养管理水平，尤其是要做好圈舍垫料的替换及挤奶时乳头的消毒工作。针对耐药严重的地区，可以尝试噬菌体或益生菌等生物制剂来积极应对抗生素危机。