天然免疫信号蛋白在仙台病毒感染过程中聚集于应激颗粒

吴 琼，孙英杰，丁 铲，廖 瑛

（中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

一些病毒感染真核细胞时，细胞迅速终止蛋白翻译，在细胞质中形成的致密颗粒状聚合体，即应激颗粒（Stress granule, SG）[1]。RNA病毒主要通过复制过程中的中间产物双链RNA，激活PKR，磷酸化eIF2α，使蛋白翻译起始所需的三元复合物eIF2-GTP-Met-tRNAMet不能循环利用，蛋白翻译停滞[2]，多聚核糖体解离，mRNA和翻译相关元件在细胞质中与G3BP1（Ras GTPase-activating protein binding protein 1）和TIA1（T cell restricted intracellularantigen-1）等核心蛋白聚集形成SG。

已有报道表明，SG能够招募RNA感受器RIG-I和PKR，启动干扰素信号通路，促进抗病毒天然免疫应答[3]。因此，许多病毒感染进化出抑制SG的机制，抵御其抗病毒作用[4-5]。例如：Theiler氏鼠科脑脊髓炎病毒（Theiler's murine encephalomyelitis virus,TMEV）在感染细胞时，病毒非结构蛋白L抑制SGs的形成[6]。麻疹病毒（Measles virus, MV）在感染细胞后，细胞中不产生SG；与野生型毒株相比，麻疹病毒C蛋白缺失的毒株能诱导SG的形成，说明C蛋白在抑制SG形成的过程中发挥了重要作用，但机制尚不明确[5]。少部分报道显示，病毒利用SG来帮助自身的复制[7-9]。如西尼罗河病毒（West Nile virus,WNV）RNA 3'端茎环结构可以通过对SG成核蛋白TIA1的“劫持”，抑制对亚砷酸钠应激诱导产生的SGs的形成，从而促进病毒的复制[7,10]。SG是一个动态的RNA和蛋白聚合物结构，当细胞压力缓解后，SG解聚，mRNA和翻译相关因子回归到核糖体，重启蛋白翻译；如果压力持续存在，SG的mRNA进入P小体（processing bodies），发生降解，蛋白则由自噬小体降解[11-12]。

宿主受到病毒感染时，会启动一系列的抗病毒反应。在感染初期，宿主细胞主要通过天然免疫应答抵御病毒侵染：即通过细胞内的模式识别受体（pattern recognition receptors, PRRs），识别DNA或RNA病毒的病原相关分子模式（pathogen-associated molecular pattern, PAMP），激活天然免疫应答信号通路，诱导机体产生干扰素（interferon, IFN）、干扰素刺激基因（interferon stimulated gene, ISG）和炎性细胞因子，使周围细胞处于警戒状态，抵御病毒的进一步感染和扩散[13]。识别RNA病毒感染的PRRs主要包括toll样受体（Toll-like receptors, TLRs）、RIG-I样受体（retinoic acid-inducible gene I (RIG-I)-like receptors, RLRs），以及PKR（protein kinase R,PKR）[14-15]。TLR3主要位于内体膜上，识别通过内吞途径进入内含体的病毒RNA[16-17]。RIG-I和MDA5位于细胞质，负责识别进入细胞质的病毒RNA[18]。PKR位于细胞质，主要识别病毒复制过程中产生的双链RNA[19-20]。PRRs识别病毒核酸后，通过招募各自的适配器，将信号传到各个激酶，最终通过磷酸化修饰激活转录因子NF-κB或IRF3/7，进入细胞核，诱导促炎性细胞因子、趋化因子和Ⅰ型IFN的产生。细胞因子分泌到细胞外，结合细胞表面受体，激活JAK-STAT信号通路，诱导干扰素刺激基因（IFN stimulated genes, ISGs）的表达，或激活免疫细胞，抵御病毒的感染[21-22]

仙台病毒（Sendai virus, SeV）于20世纪50年代在日本仙台发现[23]，为单链负链RNA包膜病毒，属于副粘病毒家族，平均直径为260 nm[24]。SeV主要感染啮齿类动物和猪，引起呼吸道症状。自从被发现以来，SeV被广泛应用于研究：SeV对人类无致病性，对多株肿瘤细胞中具有感染性，在动物模型中具有溶瘤作用，可开发为溶瘤病毒[25-26]；SeV介导真核细胞发生膜融合，可应用于制备单克隆抗体的杂交瘤细胞[27]；完整的活性SeV常作为IFN表达的诱导因子，用于IFN的大规模生产[28-29]；SeV也可作为表达载体，应用于制备全能干细胞，或者应用于制备疫苗[30-31]。

我们的前期研究发现，不少病毒感染细胞时，天然免疫信号蛋白聚集到SG。已有的研究报道表明，SeV通过C蛋白限制双链RNA的形成，避免激活PKR-eIF2α-SG通路[32]；C蛋白缺陷型SeV能诱导类似于SG的颗粒聚集[33]；没有进入核衣壳的病毒RNA，被招募到了SG[33]。SeV为何通过C蛋白抑制SG的形成？病毒RNA聚集到C蛋白缺陷型SeV诱导的SG，发挥了什么作用？是否参与促进IFN反应？本研究通过检测PRRs和天然免疫信号传递蛋白在SeV感染过程中的亚细胞定位，解析以上科学问题。我们发现SeV感染能够诱导一部分细胞形成SGs。对这部分形成SG的细胞进行间接免疫荧光观察，发现PRRs和天然免疫信号传递信号蛋白聚集到SG。我们推测SeV感染细胞时，PRRs迁移到SGs，识别病毒RNA，进一步招募天然免疫信号传递蛋白，最终促进干扰素反应。由于SG发挥了感染信号识别和信号传递平台的作用，不利于病毒复制，病毒进化出拮抗机制，通过C蛋白减少双链RNA的累积，逃逸对PKR的激活和SG的形成。

1 材料与方法

1.1 主要试剂鼠G3BP1单克隆抗体（mouse monoclonal anti-G3BP1, ab56574）和兔G3BP1单克隆抗体（Rabbit Anti-G3BP antibody, ab181150）购自Abcam公司；兔MDA5单克隆抗体（rabbit monoclonal anti-MDA5, 5321T）和RIG-I单克隆抗体（rabbit monoclonal anti-RIG-I, 3743S）、兔TBK1单克隆抗体（rabbit monoclonal anti-TBK1, 38066S）、兔IKKε单克隆抗体（rabbit monoclonal anti-IKKε,9966T）、兔TAK1单克隆抗体（rabbit monoclonal anti-TAK1, 5206S）、兔DDX3单克隆抗体（rabbit monoclonal anti-DDX3, 8192S）、兔IKKβ单克隆抗体（rabbit monoclonal anti-IKKβ, 9966T）、兔A20单克隆抗体（rabbit monoclonal anti-A20, 5630S）和兔CYLD单克隆抗体（rabbit monoclonal anti-CYLD,8462S）购自Cell Signaling Technology公司。

1.2 细胞与病毒HeLa细胞购自ATCC，并由本实验室保存。用含10%FBS（Hyclone）和1%青霉素/链霉素的DMEM（Gibco），置于含5%CO2、37℃恒温细胞培养箱中培养。SeV由扬州大学张泉馈赠，并由本实验室保存。

1.3 SeV感染用镊子取25 mm细胞飞片在酒精灯外焰灭菌，凉却后轻轻放入6孔细胞板中。将HeLa细胞按5～6×105个铺至细胞板中，摇晃均匀，置于5%CO2、37℃细胞培养箱中培养。待细胞密度长至70%～80%，进行接毒实验。取无菌15 mL离心管，用无血清的DMEM稀释病毒，每孔细胞加入1 mL的无血清DMEM稀释的病毒液，病毒感染量为1 MOI（multiplicity of infection）。置于5%CO2、37℃细胞培养箱孵育1 h，PBS清洗3遍细胞，加入含2%FBS的DMEM，置于细胞培养箱继续培养。待感染后16 h，收取细胞样品，进行间接免疫荧光实验。

1.4 polyI:C转染用镊子取25 mm细胞飞片在酒精灯外焰灭菌，凉却后轻轻放入6孔细胞板中。消化HeLa细胞或Vero细胞，将细胞按5～6×105个铺至细胞板中，待细胞长至70%左右时进行转染。转染时需要准备无RNA酶EP管及枪头，EP管中加入Opti-MEMTM减血清培养基100 μL，按照质量体积比1∶2先加入转染试剂Fugene，吹打混匀后静止5 min，然后再加入2 μg polyI:C，再次轻轻吹打混匀后室温静置15 min，最后将其滴加在事先铺满Opti-MEM™的细胞孔内。

1.5 间接免疫荧光（indirect immunofluorescence assay, IFA）病毒感染后的16 h，吸去培养基，用PBS清洗3遍，每孔加入1 mL含4%多聚甲醛的PBS固定液，室温固定10 min。吸去多聚甲醛固定液，PBS清洗3遍，每孔加入1 mL含0.5%Triton X-100的PBS透化液，室温透化10 min。吸去透化液，用PBS清洗3遍，每孔加入1 mL含3%BSA的PBS封闭液，放入37℃恒温箱中封闭30 min。吸去封闭液，用PBS清洗3遍，跟G3BP1抗体稀释液37℃共孵育1 h；TBST清洗3遍，加入荧光二抗稀释液37℃共孵育30 min。TBST清洗3遍，依次孵育第二组一抗和荧光二抗。全部抗体孵育完毕后，TBST清洗3次，跟DAPI稀释液37℃共孵育15 min。弃去DAPI稀释液，TBST清洗3次，加抗荧光淬灭封片剂，将细胞飞片取出，吸干多余水分放到载玻片上，置于黑暗处过夜晾干。通过ZEISS激光共聚焦显微镜观察SG的形成和相关蛋白的亚细胞定位。

2 结果

2.1 MDA5和RIG-I在SeV的感染过程中聚集于SGs在病毒的感染过程中，PRRs识别病毒感染产生的PAMP，发生信号传递，最终发生抗病毒反应。我们推测参与识别病毒感染的PRRs，在病毒感染过程中会发生细胞内迁移，在空间上接近PAMP。RIG-I和MDA5主要识别细胞质中的病毒双链RNA，激活位于线粒体的MAVS，传递信号到TBK1和IKKε，最终激活IRF3，诱导IFN的表达[17]。在本研究中，我们首先检测SeV感染是否诱导细胞形成SG；同时检测在SeV感染过程中，RIG-I和MDA5 的亚细胞定位是否发生变化。以1 MOI SeV感染宫颈癌细胞HeLa，设置模拟感染（mock infection）为对照组。感染后16 h，利用G3BP1鼠抗和MDA5兔抗，或G3BP1鼠抗和RIG-I兔抗，对细胞进行免疫荧光染色，检测SG核心蛋白G3BP1和MDA5或RIG-I的亚细胞定位。G3BP1的聚集，是SG形成的标志。如图1所示，在模拟感染的对照组，G3BP1均匀分布于细胞质，没有观察到G3BP1聚集颗粒的形成；MDA5和RIG-I均匀分布于细胞质和细胞核；在SeV感染的实验组，大部分感染细胞中的G3BP1均匀分布在细胞质，MDA5和RIG-I也均匀分布于细胞质和细胞核；只有少部分感染细胞的G3BP1发生点状聚集，形成SG；同时，MDA5和RIG-I也发生点状聚集，跟G3BP1颗粒共定位。以上结果说明SeV感染在大部分细胞不诱导形成SGs，仅诱导一小部分细胞形成SG； MDA5和RIG-I迁移到SGs。

图1 RIG-I和MDA5的免疫荧光共聚焦实验Fig.1 Confocal immunofluorescence assay of RIG-I and MDA5

2.2 IRF3信号通路蛋白激酶TBK1和IKKε在SeV的感染过程中聚集于SG已有报道显示C蛋白缺陷型SeV感染后，诱导大量SG形成，没有核衣壳蛋白包裹的病毒RNA进入SG[33]。本研究发现RIG-I和MDA5迁移到SG，说明这两个PRRs很有可能在SG对病毒RNA进行识别，并进一步激活MAVS，在线粒体膜上发生聚集，招募并激活下游信号蛋白TRAF3，形成IKKε/TBK1复合体，磷酸化激活IRF3进入细胞核，诱导IFN的表达和分泌[17]。RIG-I和MDA5对MAVSIKKε/TBK1的激活，需要有空间上的接触。我们接下来检测IKKε和TBK1在SeV感染过程中的亚细胞定位。以1 MOI SeV感染HeLa细胞，设置模拟感染为对照组。感染后16 h，利用G3BP1鼠抗和TBK1兔抗，或G3BP1鼠抗和IKKε兔抗进行免疫荧光实验，检测SG核心蛋白G3BP1和IRF3信号通路的激酶TBK1或IKKε的亚细胞定位。如图2所示，在模拟感染的细胞中，G3BP1均匀分布于细胞质，没有观察到SG的形成；TBK1或IKKε也均匀分布于细胞质和细胞核；在SeV感染的细胞中，一部分细胞的G3BP1发生点状聚集，形成SG；TBK1和IKKε发生点状聚集，跟G3BP1颗粒共定位。以上结果说明TBK1和IKKε聚集于SeV诱导的SG，参与信号传递。

图2 TBK1和IKKε的免疫荧光共聚焦实验Fig.2 Confocal immunofluorescence assay of TBK1和IKKε

2.3 NF-κB信号通路蛋白激酶TAK1，IKKβ和RNA解旋酶DDX3在SeV的感染过程中聚集于SG作为TLRs模式识别受体的信号蛋白，TLR3主要识别RNA病毒，招募信号蛋白MyD88，激活TRAF6；TRAF6经过k63连接的聚泛素化，作为一个支架蛋白招募TAK1；磷酸化的TAK1随后磷酸化激活IKKα/β/γ复合物[16]；IKKβ进一步对IκB进行磷酸化；IκB随后发生泛素化降解，释放转录因子NF-κB进入细胞核，启动IFNβ、TNFα和IL6等细胞因子的表达[17]。DDX3（DEAD-box helicase 3）是RNA解旋酶，参与天然免疫信号转导，常常被病毒劫持以促进复制[34-35]。已有的研究表明，过表达DDX3促进SG组装，而敲减DDX3的表达则抑制SG组装；同时DDX3的解旋酶活性对SG组装必不可少，且DDX3与eIF4E结合是SG组装所必需的[36]。DDX3的RNA解旋酶活性使mRNA从RNA颗粒中逃逸并在多聚体处恢复翻译[37]。TAK1和IKKβ参与信号传递，DDX3不但参与信号传递，还是SGs组装过程中必不可少的蛋白。本研究进一步对在SeV感染过程中，这些信号蛋白是否迁移到SG进行检测。以1 MOI SeV感染HeLa细胞，设置模拟感染为对照组。感染后16 h，利用G3BP1鼠抗和TAK1兔抗、G3BP1鼠抗和IKKβ兔抗，或G3BP1鼠抗和DDX3兔抗进行免疫荧光实验，检测G3BP1和NF-κB信号通路的蛋白激酶TAK1、IKKβ、或RNA解旋酶DDX3的亚细胞定位。如图3所示，在模拟感染的细胞中，G3BP1均匀分布于细胞质，没有观察到SG的形成；蛋白激酶TAK1、IKKβ，或RNA解旋酶DDX3也均匀分布于细胞质和细胞核；在SeV感染的一部分细胞中，G3BP1形成点状聚集，形成SGs；TAK1、IKKβ或DDX3也形成点状聚集，跟G3BP1共定位。以上结果说明SeV感染诱导TAK1、IKKβ和DDX3聚集于SGs。

图3 TAK1、DDX3和IKKβ的免疫荧光共聚焦实验Fig.3 Confocal immunofluorescence assay of TAK1、DDX3和IKKβ

2.4 泛素化酶和去泛素化酶A20以及去泛素化酶CYLD在SeV的感染过程中聚集于SGA20，也被称为肿瘤坏死因子诱导蛋白3（tumor necrosis factor induced protein 3, TNFIP3），具有泛素连接酶和去泛素化酶的功能，由NF-κB诱导表达，对RIP1和其他信号转导蛋白进行泛素化或去泛素化，负向调控NF-κB信号的强度和持续时间，形成负反馈回路[38-39]。A20阻止了IFN和细胞因子的大量表达，对免疫系统的稳态至关重要。CYLD（cylindromatosis）是一种去泛素化酶，属于去泛素化酶USP家族（ubiquitinspecific proteases），通过其C末端的泛素水解结构域，可以特异性的从蛋白底物上除去K63连接的泛素链，从而改变靶蛋白的功能[40-42]。同时，CYLD还具有一个特异性位点，可以与肿瘤坏死因子受体相关因子2（tumor receptor-associated factor 2, TRAF2）和NF-κB信号通路激酶（(NF)-kappaB essential modulator, NEMO）结合[43]。因此，A20和CYLD在NF-κB号通路的调节中发挥着重要的作用[44]。我们接下来对A20和CYLD进行检测，观察其在SeV感染过程中亚细胞定位的变化。以1 MOI SeV感染HeLa细胞，设置模拟感染为对照组。感染后16 h，利用G3BP1鼠抗和A20兔抗，或用G3BP1鼠抗CYLD兔抗进行免疫荧光实验，检测G3BP1和泛素化相关酶A20或CYLD的亚细胞定位。如图4所示，在模拟感染的细胞中，G3BP1均匀分布于细胞质，没有观察到SG的形成；A20和CYLD也均匀分布于细胞质和细胞核；在SeV感染组，一部分细胞中的G3BP1形成点状聚集，形成SGs；A20和CYLD形成点状聚集，跟G3BP1共定位。以上结果说明SeV感染诱导SGs的形成，参与信号传导的A20和CYLD聚集于SGs。

图4 A20和CYLD的免疫荧光共聚焦实验Fig.4 Confocal immunofluorescence assay of A20和CYLD

2.5 A20及其磷酸化形式p-A20在poly I:C刺激下聚集于SG如前所述，在SeV感染Hela细胞的过程中，很多与天然免疫相关的信号蛋白会聚集到SG。然而，信号蛋白聚集到SG是否为SEV感染细胞特有的现象，尚不清楚。poly I:C是病毒双链RNA模拟物，能够通过激活PKR，刺激SG的形成，并激活干扰素信号通路。因此，poly I:C刺激能够模拟RNA病毒感染。我们将探讨在poly I:C刺激细胞后，天然免疫信号蛋白是否聚集于SG。我们接下来以A20及磷酸化活化的A20（p-A20）为代表性蛋白进行检测和分析。在HeLa细胞中转染poly I:C，设置PBS转染为对照组。转染后16 h，利用G3BP1鼠抗和A20兔抗或p-A20兔抗进行免疫荧光实验，检测G3BP1和A20及p-A20的亚细胞定位。如图5所示，在PBS刺激的细胞中，G3BP1均匀分布于细胞质，没有观察到SG的形成；A20均匀分布于细胞质和细胞核；在poly I:C刺激的细胞中，G3BP1形成点状聚集，形成SG；一定比例的A20和p-A20形成点状聚集，跟G3BP1共定位。以上结果说明poly I:C刺激能诱导SG的形成，参与信号传导的A20及其活性形式p-A20聚集于SG。以上结果揭示，信号蛋白聚集到SG并不是SEV感染特有的现象。

图5 A20和p-A20的免疫荧光共聚焦实验Fig.5 Confocal immunofluorescence assay of A20和p-A20

3 讨论

在病毒感染细胞时，天然免疫应答是宿主的第一道抵御防线。干扰素是天然免疫应答的关键抗病毒蛋白，由PRRs识别病毒感染后，激活IRF3/IRF7或NF-κB诱导表达。病毒感染产生的双链RNA，结合并激活PKR，PKR进一步磷酸化eIF2α，使蛋白翻译所需的三元复合物eIF2-GTP-Met-tRNAMet不能循环利用，细胞迅速终止蛋白翻译，在细胞质中形成的致密颗粒状聚合体SG，临时储存mRNA和翻译元件。已有的研究显示，RIG-I和PKR在NS1缺失的禽流感A型病毒（Influenza A virus, IAV）的感染过程中，迁移到SG，SG发挥促进干扰素反应的作用[45]，因此，SG在IAV的感染中，具有抗病毒作用。IAV进化出干扰SG形成的机制：非结构蛋1（NS1）通过抑制PKR的激活，避免磷酸化eIF2α，从而不诱导SG的形成；而NS1缺失型IAV（IAV-NS1），则显著地诱导依赖于PKR-eIF2α途径的SG形成[3,45]。有报道显示：脊髓灰质炎病毒（Poliovirus, PV）和脑心肌炎病毒（Encephalomyocarditis virus, EMCV)，这两种病毒能暂时诱导SG形成，但是病毒3C蛋白具有切割SG核心蛋白G3BP1的功能，从而抑制SG形成[19,46]。有研究表明，SeV通过C蛋白减少双链RNA的累积，逃逸对PKR的激活和对SG的诱导。C蛋白缺陷型SeV有效刺激SG的形成，没有核衣壳的病毒RNA迁移到SG。SeV具有拮抗SG的机制，那么，SG在SeV感染过程中，是否发挥抗病毒作用呢？

在本研究中，我们发现SeV感染HeLa细胞的过程中，大部分感染的细胞不形成SG，一小部分细胞形成SGs。RNA感受器MDA5和RIG-I，下游的蛋白激酶如TBK1、IKKε、TAK1，IKKβ、RNA解旋酶DDX3、泛素化酶和去泛素化酶A20以及去泛素化酶CYLD均聚集到SG。结合前人的研究，我们推测在SeV感染细胞的过程中，病毒RNA被招募到SGs，PRRs迁移到SGs，识别病毒RNA，把信号传递给下游的激酶，最终激活IRF3/7和NF-κB，诱导干扰素反应。因此，我们预测在SeV感染过程中，SG是宿主识别病毒感染并发生信号传递的一个平台，SeV通过C蛋白拮抗SG的形成，减少宿主细胞的抗病毒反应。

天然免疫相关的信号蛋白聚集到SG，并不是SeV感染特有的现象。在我们的研究过程中，发现poly I:C刺激诱导的SG，也具有PRRs和A20等天然免疫相关蛋白。并且，G3BP1/2缺失的细胞系，在poly I:C刺激下，不能形成SG，干扰素反应明显下降。因此，SG在病毒感染过程中作为一个启动或增强天然免疫应答的信号平台，发挥抗病毒作用[47]。本研究证实了在病毒感染细胞的过程中，信号蛋白聚集到SG是一种普遍现象，为进一步明确SG在抗病毒反应中发挥的作用提供参考，同时揭示细胞压力应激与干扰素反应存在交叉联系。