禽网状内皮组织增生病毒和A亚群禽白血病病毒共感染SPF雏鸡诱导的免疫学反应

侯力丹，刘 丹，翟天舒，毛娅卿，王 嘉，孔冬妮，黄小洁，杨汉春，张亚文，赵 鹏，李俊平

（1.中国兽医药品监察所，北京 100081；2.中国农业大学动物医学院，北京 100193；3.山东农业大学动物科技学院，泰安 271018）

禽白血病病毒（Avian leukosis virus, ALV）和禽网状内皮组织增生病毒（Reticuloendotheliosis virus,REV）两种逆转录病毒是鸡群中常见的垂直传播性病毒，他们感染鸡群后不仅会导致发生肿瘤，还常常引起免疫抑制，导致疫苗免疫失败等时常发生。此前，多个流行病学调查报告显示，REV与ALV的共感染在鸡群中是一种典型的流行病学现象，共感染比单一感染对鸡群造成的致病性更强，诱导更加严重的免疫抑制。人工致病性实验结果也表明REV与ALV-J共感染具有显著的协同致病作用[1-2]。

除了经典的致病性较强的ALV-J外，流行病学调查及在对种鸡开展病毒分离鉴定的实践中发现，A亚群ALV（ALV-A）是蛋鸡中常见的流行亚群[3-4]，特别是蛋鸡群中还会出现一定比例的REV与ALV-A共感染现象。作为鸡群中最常见的两种免疫抑制性病毒，单感染REV或ALV-A以及两者共感染鸡后免疫学相关指标的系统观察，目前还未有系统的研究报道。为此本研究利用SPF鸡通过人共感染的方式使其感染上述两种病毒，后对试验鸡的多个免疫学相关的监测指标进行了检测和比较分析，观察了REV与ALV-A各自单感染或者共感染后诱导SPF鸡的免疫学反应及其差异。

1 材料与方法

1.1 细胞和毒株REV（MD-2株）分离自某污染的鸡马立克氏病疫苗中[5]，已完成其全基因组测序（GenBank登录号：JX912710）；ALV-A野毒株SDAU09C1株分离自引进的白羽肉用型祖代鸡[4]，由山东农业大学家禽肿瘤病研究室崔治中教授馈赠，已完成其全基因组测序（GenBank登录号：HM452339）。可区分内源性和外源性ALV的DF-1细胞购自美国菌种保藏中心（ATCC），用于病毒的增殖和定量。

1.2 抗体与检测试剂盒针对REV的单克隆抗体MAb11B118由山东农业大学家禽肿瘤病研究室崔治中教授馈赠，间接免疫荧光的工作浓度为1∶2000；FITC标记的羊抗鼠IgG抗体购自美国Sigma公司；RPE标记的鼠抗鸡CD8α抗体、FITC标记的鼠抗鸡CD4抗体均购自美国SouthernBioteck公司；禽白血病p27群特异性抗原酶联免疫（ELISA）检测试剂盒购自北京爱德氏元亨生物科技有限公司；用于检测鸡白细胞介素（Interleukin, IL）1、2、4、5、10、12、18，鸡肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor α,TNF-α）及鸡γ干扰素（Interferon γ, IFN-γ）等多种细胞因子的商品化ELISA检测试剂盒购自上海沪尚生物科技有限公司。

1.3 动物实验设计1日龄SPF鸡共计160只，购自北京梅里亚维通试验动物技术有限公司。随机平均分为4组，分别隔离饲养于4台负压隔离器中。第1组每只经皮下注射无菌生理盐水0.2 mL，作为空白对照组；第2组每只鸡经皮下注射ALV-A SDAU09C1株1000 TCID50，作为ALV-A单独攻毒组；第3组每只鸡经皮下注射REV MD-2株1000 TCID50，为REV单独攻毒组；第4组每只鸡经皮下注射两种病毒的混合液0.2 mL，分别含有两种病毒500 TCID50，为REV和ALV-A共感染攻毒组。于攻毒后第2周对各组SPF鸡无菌采集抗凝血接种DF-1细胞进行病毒分离，以确认REV和ALV-A感染成功。分别于攻毒后第2周、4周、6周、10周、12周、14周从每个实验组各取6只SPF鸡，无菌采血分别分离淋巴细胞和血清。

1.4 REV与ALV-A共感染对细胞因子含量的影响对1.3中不同时间节点采集的血清样品，分别应用各种细胞因子ELISA检测试剂盒，按照试剂盒使用说明书分别检测鸡IL-1、2、4、5、10、12、18，TNF-α和IFN-γ的浓度，相关数据使用t-test统计分析各组不同细胞因子浓度差异。

1.5 REV与ALV-A共感染对外周血T淋巴细胞分群的影响采集抗凝血，分离淋巴细胞并对其进行计数。按照流式细胞术的步骤将淋巴细胞处理为107个/mL的密度，分别以CD8α抗体和CD4+抗体对其进行染色，进行CD8+及CD4+细胞计数，并计算CD4+/CD8+比值，以t-test统计分析各组间数据差异。

1.6 REV与ALV-A共感染对外周血细胞部分Toll样受体mRNA转录水平的影响参照NCBI上已公布的鸡β-Actin及Toll样受体（Toll-like receptors,TLRs）的mRNA序列，使用Primer Version 5.00软件（PREMIER Biosoft international，3786 Corina Way，Palo Atto，CA）分别设计和合成用于检测β-Actin、chTLR2 type1、chTLR3、chTLR4、chTLR5、chTLR6、chTLR7、chTLR15等各受体基因的real-time PCR检测引物（表1），以上述引物扩增各基因片段后构建的克隆质粒为模板，绘制荧光定量检测标准曲线。对提取的外周血淋巴细胞总mRNA首先以d18T为引物进行反转录扩增，然后以各相关引物对cDNA进行real-time PCR检测。统计分析各组间Toll样受体mRNA转录水平的差异。

表1 荧光定量 PCR引物列表Table 1 Primers of real-time PCR

2 结果

2.1 REV与ALV-A病毒分离结果REV单感染和共感染后2周，对REV感染后的鸡采血接种DF-1细胞，接种细胞后第7 d时以细胞固定液固定，然后以REV的单克隆抗体MAb11B118进行间接免疫荧光检测，所有细胞样品均显示出典型的染色特征（图略），判定为存在REV感染，证实人工攻毒实验成功，血液中REV分离阳性率均为100%。ALV-A单感染和共感染后2周，对ALV-A感染后的鸡采血接种DF-1细胞，接种细胞后7 d时取细胞上清液，所有上清液以禽白血病p27群特异性抗原酶联免疫（ELISA）检测试剂盒按照试剂盒说明书检测，均为阳性（S/P数值略），判定为存在ALV感染，证实人工攻毒实验成功，血液中ALV-A分离阳性率均为100%。

2.2 REV与ALV-A共感染对细胞因子变化的影响以ELISA方法检测各组鸡不同时间点IL-1等9种细胞因子的含量。如表2所示，各感染组IL-1浓度与空白对照组差异不显著，表明不管是REV与ALV-A单感染还是两者共感染对IL-1的分泌影响不显著。感染后2周时，相对ALV-A单感染组以及空白对照组，REV单感染组和共感染组的IL-2浓度出现了显著升高（P＜0.05），但在感染后12周时，各感染组IL-2浓度又极显著低于空白对照组（P＜0.01）。2～6周内，相对于空白对照组和REV单感染组，共感染组IL-18浓度升高，但差异不显著（P＞0.05）。感染2周时，各感染组的IFN-γ浓度相对于空白对照组均显著下降，共感染组显著低于空白对照组（P＜0.05）。感染4周后，各实验组IFN-γ的浓度高于空白对照组，6周后，ALV-A单感染组极显著（P＜0.01）高于空白对照组，到第10周时REV单感染组显著高于空白对照组（P＜0.05）。感染2周时，共感染组TNF-α浓度显著高于其他组（P＜0.05），但在4周时却显著低于其他组（P＜0.05）。14周时，各实验组TNF-α浓度均显著高于空白对照组（P＜0.05）。

2.3 REV与ALV-A共感染对鸡外周血CD4+及CD8+ T淋巴细胞分群的影响如表3所示，在感染后2周，各感染组较空白对照组的CD4+T淋巴细胞比例均有不同程度升高，其中REV单感染组显著高于ALV-A单感染组及空白对照组（P＜0.05）；在感染后4～12周内空白对照组CD4+T淋巴细胞比例始终高于各感染组，在第10周时共感染组显著低于REV单感染组（P＜0.05），更极显著低于空白对照组（P＜0.01）。如表4所示，在感染后2周，相对于空白对照组，各感染组CD8+T淋巴细胞比例均呈现不同程度的升高趋势，其中REV单感染组极显著高于ALV-A单感染组和空白对照组（P＜0.01），ALV-A单感染组和共感染组显著高于空白对照组（P＜0.05）；10～14周时，各感染组均高于空白对照组，特别在第12周时，各感染组CD8+T淋巴细胞比例显著或极显著高于空白对照组，在第14周时，除了REV单感染组外，ALV-A单感染组和共感染组均显著高于空白对照组（P＜0.05）。如表5所示，各组间不同采样时间节点CD4+/CD8+比值的差异较明显，其中在感染后第2周、6周时，共感染组该比值显著低于空白对照组（P＜0.05）；12周时，各感染组该比值均极显著低于空白对照组（P＜0.01）。

2.4 REV与ALV-A共感染对外周血细胞部分Toll样受体mRNA转录水平的影响以表1所列引物分别对外周血淋巴细胞中β-Actin以及多种Toll样受体进行了Real-Time PCR检测，以Toll样受体基因的Ct值与同一样品β-ActinCt值的比值来表示Toll样受体相对转录水平。如表6所示，在所有时间节点，各组间chTLR2 type1和chTLR6相对转录水平均无显著性差异（P＞0.05）。对于chTLR3、chTLR4、chTLR5和chTLR7相对转录水平，除了感染后10周时ALV-A单感染组极显著高于对照组外（P＜0.01），各组间其他时间点均无显著差异（P＞0.05）。

3 讨论

REV和ALV作为鸡群中常见的两种免疫抑制性病毒，其单独感染或者共感染后导致的免疫抑制一直是备受关注的问题，特别是导致禽流感和新城疫等疫苗免疫失败是对家禽生产的重大危害之一[1-2]。此前，对REV和ALV诱导的免疫抑制主要是从疫苗免疫后的抗体滴度等角度观察两者单独感染或者共感染后的免疫抑制作用，对于两者单独感染或者共感染对先天免疫反应和细胞免疫反应方面的影响，一直缺乏系统的研究数据。为此本研究通过在动物试验中对血清中代表性细胞因子的含量、外周血T淋巴细胞分群以及外周血部分Toll样受体mRNA转录水平等多项指标的监测与比较，来分析REV和ALV-A两者单独或者共感染状态下诱导SPF雏鸡免疫反应的差异性。

表2 REV与ALV-A单感染及共感染对鸡血清细胞因子浓度的影响（±SD，单位：ng/L）Table 2 Influence on concentration of cytokines in chicken serum infected with REV or/and ALV-A（±SD, unit: ng/L）

表3 REV与ALV-A单感染及共感染对鸡外周血CD4+细胞比例的影响（±SD，单位：%）Table 3 Influence on percentage of CD4+ in peripheral blood infected with REV or/and ALV-A（±SD, unit: %）

表4 REV与ALV-A单感染及共感染对鸡外周血CD8+细胞比例的影响(± SD，单位: %)Table 4 Influence on percentage of CD8+ in peripheral blood infected with REV or/and ALV-A (± SD, unit: %)

表5 REV与ALV-A单感染及共感染对鸡外周血CD4+/CD8+比值的影响（±SD）Table 5 Influence on ratio of CD4+/CD8+ in peripheral blood infected with REV or/and ALV-A（±SD）

表6 REV与ALV-A单感染及共感染鸡外周血淋巴细胞chTLRs mRNA相对转录水平（±SD）Table 6 Relative transcription level of chTLRs in peripheral blood infected with REV or/and ALV-A（±SD）

近年来，鸡相关细胞因子的研究取得多项进展，如IL-1、IL-2、IL-4等。本研究选择9种代表性细胞因子进行了测定，结果表明REV与ALV-A单感染或共感染对鸡血清中IL-1等9种细胞因子的浓度总体影响不显著，但在感染后12周或14周时，共感染会使IL-2、IL-4浓度下降且显著低于空白对照组。IL-2具有非常重要的免疫调节作用，能调控免疫系统中白血球的细胞活性，促进Th和CTL的增殖，促进B细胞分化及分泌抗体、诱导产生其他细胞因子、增强单核细胞和NK细胞杀伤活性等多种功能[6]。IL-4主要在调节体液免疫中起重要作用，能刺激活化B细胞增殖和成熟及促进抗体的生成、诱导T细胞增殖和抗凋亡、参与调节CD4+T细胞分化成TH2型细胞[7]。相关数据证实REV与ALV-A共感染会使IL-2、IL-4浓度下降，其结果必然会进一步影响疫苗免疫抗体的产生。

T淋巴细胞是重要免疫细胞，根据表面抗原结合受体的不同将其分为不同亚群，其中CD4+细胞为辅助性T淋巴细胞（TH细胞），CD8+细胞为细胞毒性T细胞（TC细胞），CD4+和CD8+及其比值是相对稳定的，但是也受鸡遗传背景和性成熟程度等多种因素的影响，并受神经和内分泌系统的调控[8]。在病理状态下，病毒等感染后上述指标更会发生显著变化，其中CD4+/CD8+T细胞比值作为重要的参考指标，已经在多种疾病的诊断方面被广泛应用[9-10]。本研究发现，不同实验组的CD4+与CD8+T细胞数量在感染后2周均明显升高，但CD4+T细胞在之后较长时间（4～12周）表现为下降，尤其共感染组下降幅度最大。ALV-A单感染组在大部分时间引起的CD8+T淋巴细胞数明显升高，12周时显著高于其他各组，14周时显著高于空白对照组和REV单感染组。第2～12周，与各感染组相比，共感染组引起CD4+/CD8+比值显著低于对照组，这表明ALV-A和REV共感染导致的细胞免疫水平下降更加显著。

模式识别受体TLRs是病原微生物激活天然免疫系统的关键受体，目前已在鸡的基因组中发现超过10种TLRs，对多个TLRs在鸡组织及细胞中的表达已有系统研究报道[11]。多种TLRs在免疫抑制性病毒感染过程中的作用已有相关报道，施蕾等[12]发现chTLR3参与鸡传染性法氏囊病毒感染。有研究表明chTLR7可能参与了病毒感染早期的天然免疫反应过程[13]。chTLR15是禽类特有的高度保守的TLRs[14]，感染肠炎沙门菌后TLR15的表达水平显著上调，且与TLR2的表达密切相关。本研究应用荧光定量PCR检测了多种TLRs的mRNA相对转录水平，结果表明仅在感染后10周时ALV-A单感染组的chTLR3、chTLR4、chTLR5和chTLR7相对转录水平极显著高于空白对照组，chTLR15相对转录水平显著高于空白对照组，呈现出与肠炎沙门菌感染后类似的上调规律。

综上所述，尽管在个别时间点REV与ALV-A单感染及共感染引起部分细胞因子浓度呈现显著变化，但变化幅度不大且规律不明显，鸡血清中各种细胞因子的浓度受REV与ALV-A感染影响小，相对稳定。在感染2周后较长时间内，不管是REV与ALV-A单感染还是共感染，其CD4+/CD8+比值均出现了不同程度的下降，共感染组下降尤其明显，表明不同感染状态对细胞免疫有抑制作用，其中共感染明显加重对鸡群的免疫抑制。本研究为加深对REV和ALV-A单感染或者共感染诱导鸡群发生免疫抑制的理解提供了新的数据。