广东紫珠中的萜类化合物及其抗炎活性

黄逸敏，袁 欢，陈 萍，王 涛，彭光天，吴爱芝

广州中医药大学中药学院，广州510006

广东紫珠(CallicarpakwangtungensisChun.)为马鞭草科紫珠属(CallicarpaL.)落叶灌木，是该属代表性药物植物，为岭南地区常用药材，主要分布在广东、广西、江西和湖南等地[1]。该品种药材收录于2020版《中国药典》一部，具有收敛止血，散瘀，清热解毒等功效，常用于治疗衄血、咯血、吐血、便血、崩漏，外伤出血、肺热咳嗽、咽喉肿痛和热毒疮疡等，是“抗宫炎”系列中成药的主要原料药材[2]。此外，广东紫珠在长江以南地区还可用于日常茶饮。本课题组成员近几年来对紫珠属植物枇杷叶紫珠(C.kochiana)、全缘叶紫珠(C.integerrima)、裸花紫珠(C.nudiflora)、长柄紫珠(C.longipes)和广东紫珠(C.kwangtungensis)的化学成分进行了较为系统地研究[3-7]，发现萜类成分在该属植物中广泛存在，为该属植物中低极性部位的主要化学成分类型。经笔者系统查阅文献整理发现紫珠属植物中已报道的萜类成分有131种，其中三萜37种，二萜84种，倍半萜10种。

一氧化氮(NO)是由L-精氨酸在一氧化氮合酶(NOS)家族的作用下合成的一种自由基，在许多不同的生化过程中作为细胞信号分子发挥作用[8]。近年来，越来越多的研究表明NO是炎症反应的关键标志物，在各种炎症疾病的发生发展过程中发挥关键作用，抑制过多NO的生成已成为治疗炎症性疾病的有效策略[9]。现代药理研究表明，萜类化合物具有良好的抗炎生物活性[10-12]。为了丰富广东紫珠中萜类成分的化学结构类型并为其后续药理活性研究奠定丰富的物质基础，本文将运用多种色谱方法对广东紫珠甲醇提取物中低极性部位的萜类化合物进行成分分离和结构鉴定。为了明确这些萜类成分的抗炎作用，将采用LPS 诱导RAW 264.7小鼠巨噬细胞建立体外炎症模型，运用Griess 法评价广东紫珠中萜类成分的抗炎效果，初步分析萜类化合物结构对抗炎活性的影响。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

安捷伦1260高效液相色谱仪(德国安捷伦公司)；DRX 400型核磁共振仪(德国Bruker)；AB Sciex Triple TOF 5600+质谱仪(美国AB Sciex公司)；SW-CJ-2FD超净工作台(江苏苏净安泰公司)；MCO-20AIC型CO2培养箱(日本SANYO公司)；光学倒置显微镜(重庆市奥利巴斯公司)；Multiskan FC酶标仪(美国Thermo公司)。

柱层析硅胶精制型、薄层层析硅胶GF254(青岛海洋化工有限公司)；Sephadex LH 20(GE Healthcare)；地塞米松对照品(大连美伦生物科技有限公司)；DMEM高糖培养基(美国Gibco公司)；PBS磷酸缓冲液(美国Gibco公司)；双抗(10000U青霉素和链霉素混合液)(美国Gibco公司)；FBS 胎牛血清(美国Gibco公司)；DMSO二甲基亚砜(分析纯，阿拉丁公司)；MTT噻唑蓝(美国Sigma公司)；LPS脂多糖(大连美伦生物科技有限公司)；NO试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)。

小鼠单核巨噬细胞(RAW 264.7)：购自中国科学院上海细胞库。

实验所用广东紫珠栽培品于2016年购自于江西萍乡，经广州中医药大学中药鉴定学教研室彭光天老师鉴定为马鞭草科(Verbenaceae)紫珠属(CallicarpaL.)植物广东紫珠(C.kwangtungensisChun.)。标本(NO.20160715)存放于广州中医药大学中药学院天然产物研究室。

1.2 提取与分离

将12 kg晾干的广东紫珠枝和叶粉碎过筛，用120 L甲醇进行渗漉提取，提取液合并减压浓缩后得到浸膏1 kg，加4 L蒸馏水得到混悬液，随后依次分别用石油醚(3×4 L)、乙酸乙酯(3×4 L)、正丁醇(3×4 L)进行萃取，萃取液减压浓缩至干，得到石油醚部位85 g，乙酸乙酯部位108 g，正丁醇部位400 g，水部位260 g。

取广东紫珠甲醇提取物的乙酸乙酯萃取部位108 g经硅胶柱层析(200～300目)，依次石油醚/乙酸乙酯(1∶0→0∶1)梯度洗脱得到7个流分Fr.A～G，其中，Fr.A先经Sephadex LH 20，氯仿/甲醇(1∶1)洗脱，再经硅胶柱层析，石油醚/乙酸乙酯(200∶1→100∶1)多次洗脱，再经Sephadex LH 20柱层析纯化，甲醇洗脱，得化合物1(15 mg)。Fr.B先经Sephadex LH 20，氯仿/甲醇(1∶1)洗脱，再经硅胶柱层析，石油醚/乙酸乙酯(100∶1→80∶1)；二氯甲烷/乙酸乙酯(50∶1→30∶1)；石油醚/丙酮(12∶1)洗脱，再经Sephadex LH 20柱层析纯化，甲醇洗脱，得化合物2(20 mg)、9(125 mg)、10(12 mg)和11(20 mg)。Fr.D先经Sephadex LH-20，氯仿/甲醇(1∶1)洗脱，再经硅胶柱层析，二氯甲烷/甲醇(80∶1)；二氯甲烷/乙酸乙酯(20∶1)；石油醚/丙酮(10∶1)多次洗脱，再经Sephadex LH 20柱层析纯化，以甲醇洗脱，得化合物3(7 mg)。Fr.F先经Sephadex LH 20，氯仿/甲醇(1∶1)洗脱，再经硅胶柱层析，二氯甲烷/甲醇(75∶1)；石油醚/丙酮(20∶1)多次洗脱，再经Sephadex LH 20柱层析纯化，甲醇洗脱，得化合物4(5.6 mg)和5(15 mg)。Fr.G先经Sephadex LH 20，氯仿/甲醇(1∶1)洗脱，再经硅胶柱层析，二氯甲烷/甲醇(60∶1→40∶1)多次洗脱，再经Sephadex LH 20柱层析纯化，甲醇洗脱，得化合物6(33 mg)、7(5 mg)和8(56 mg)。

1.3 抗炎活性测试

1.3.1 细胞活力实验

取对数生长期的RAW 264.7小鼠巨噬细胞，调整细胞浓度为2×l05个/mL，每孔100 μL接种于96孔板中，设立对照组和11个实验组，每组3个复孔，于37 ℃、5% CO2培养箱培养24 h至细胞贴壁。实验组加入100 μL终浓度为12.5、25.0和50.0 μmol/L的样品(对照组加入等体积的培养基)于37 ℃、5% CO2培养箱培养24 h 后，每孔加入10 μL MTT溶液(避光操作)孵育4 h，吸净上清液，每孔加入150 μL二甲基亚砜溶液，避光振荡10 min，采用酶标仪在490 nm下测定OD值，计算细胞活力。

1.3.2 抗炎活性筛选

取对数生长期的RAW 264.7小鼠巨噬细胞，调整细胞浓度为2×l05个/mL，每孔100 μL接种于96孔板中，同时设立空白组(control)、脂多糖组(lipopolysaccharide，LPS)、地塞米松组(dexamethasone，DEX)和实验组，每组4个复孔，于37 ℃、5% CO2培养箱培养24 h至细胞贴壁。实验组加入100 μL终浓度为50.0 μmol/L的样品(空白组和LPS组加入等体积的培养基)孵育 2 h，再加入 1 μL 终浓度为 1.0 μg/mL的LPS刺激(空白组加入等体积培养基)24 h，用Griess 法测定上清液中 NO的含量。

2 实验结果

2.1 结构鉴定

化合物1淡黄色固体；ESI-MS：m/z665 [M+H]+；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：4.68(1H，br s，Ha-29)，4.57(1H，br s，Hb-29)，4.45(1H，m，H-3)，1.68(3H，s，30-CH3)，1.0～2.5(28H，H-2′～H-15′)，1.03(3H，s，H-26)，0.94(3H，s，H-27)，0.85(3H，s，H-25)，0.84(9H，s，H-23，H-24，H-28)，0.78(3H，s，H-16′)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：173.9(C-1′)，151.1(C-20)，109.5(C-29)，80.8(C-3)，55.5(C-5)，50.5(C-9)，48.4(C-19)，48.2(C-18)，43.1(C-17)，42.9(C-14)，41.0(C-8)，40.1(C-22)，38.5(C-1)，38.2(C-13)，38.0(C-4)，37.2(C-10)，35.7(C-16)，35.0(C-2′)，34.3(C-7)，32.1(C-3′)，30.0(C-4′)，29.8(C-21)，29.8(4CH2，C-5′～C-8′)，29.7(C-10′)，29.6(C-9′)，29.5(C-11′)，29.4(C-12′)，29.3(C-13′)，28.1(C-23)，27.6(C-15)，25.3(C-12)，25.2(C-14′)，23.9(C-2)，22.9(C-15′)，21.1(C-11)，19.4(C-30)，18.3(C-6)，18.2(C-28)，16.7(C-24)，16.3(C-25)，16.1(C-26)，14.7(C-27)，14.3(C-16′)。以上数据与文献[13]基本报道一致，故鉴定化合物为sambucunlin A(结构见图1)。

图1 化合物1～11的化学结构Fig.1 The chemical structures of compounds 1-11

化合物2白色针晶；ESI-MS：m/z443 [M+H]+；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：4.74(1H，s，H-29a)，4.61(1H，s，H-29b)，3.19(1H，m，H-3)，3.00(1H，m，H-2)，1.69(3H，s，H-30)，1.25(3H，s，H-26)，0.97(3H，s，H-27)，0.93(3H，s，H-25)，0.82(3H，s，H-24)，0.75(3H，s，H-28)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：150.2(C-20)，109.5(C-29)，78.8(C-3)，56.1(C-2)，55.2(C-5)，50.3(C-9)，49.1(C-18)，46.7(C-19)，42.3(C-8)，40.5(C-22)，38.7(C-14)，38.5(C-17)，38.2(C-1)，37.0(C-4)，36.9(C-16)，34.1(C-10)，34.0(C-13)，32.0(C-7)，30.4(C-21)，29.5(C-23)，27.8(C-15)，27.2(C-12)，25.3(C-11)，20.7(C-30)，19.2(C-6)，18.1(C-28)，16.0(C-24)，15.9(C-25)，15.2(C-26)，14.5(C-27)。以上数据与文献[14]基本报道一致，故鉴定化合物为2α-hydroxy-lupeol。

化合物3白色粉末；ESI-MS：m/z487 [M+H]+；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：5.97(1H，s，H-12)，5.65(1H，s，H-11)，5.36(1H，s，H-18)，4.05(1H，s，H-2)，3.45(1H，s，H-3)，2.13(3H，s，H-29)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：213.1(C-19)，180.8(C-28)，144.4(C-13)，130.6(C-12)，128.3(C-11)，126.6(C-18)，79.7(C-3)，67.1(C-2)，54.7(C-5)，48.5(C-9)，48.0(C-10)，47.6(C-11)，42.3(C-1)，42.0(C-14)，41.5(C-8)，39.1(C-4)，38.84(C-22)，38.75(C-10)，32.6(C-7)，29.0(C-24)，28.2(C-29)，27.5(C-21)，26.6(C-16)，23.5(C-15)，22.0(C-27)，20.7(C-25)，19.6(C-6)，18.6(C-23)，17.2(C-26)，17.1(C-30)。以上数据与文献[15]报道基本一致，故鉴定该化合物为swinhoeic acid 。

化合物4白色固体；ESI-MS：m/z452[M+H]+；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：5.96(1H，d，J=10.4 Hz，H-12)，5.53(1H，dd，J=10.3，3.1 Hz，H-11)，3.22(1H，dd，J= 11.3，5.0 Hz，H-3)，2.12(1H，dd，J= 13.2，5.8 Hz，H-18)，1.16(3H，s，H-27)，1.05(3H，s，H-26)，1.00(6H，d，J= 5.9 Hz，H-23，29)，0.93(3H，s，H-30)，0.91(3H，s，H-25)，0.79(3H，s，H-24)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：180.1(C-28)，133.6(C-12)，128.9(C-11)，89.8(C-13)，79.0(C-3)，60.7(C-18)，54.9(C-5)，53.2(C-9)，45.2(C-17)，41.8(C-8)，40.4(C-14)，40.3(C-20)，39.1(C-4)，38.4(C-1)，38.3(C-19)，36.5(C-10)，31.5(C-22)，31.4(C-7)，30.8(C-21)，27.9(C-23)，27.1(C-2)，25.7(C-15)，22.8(C-16)，19.3(C-30)，19.0(C-26)，18.1(C-25)，18.0(C-29)，17.7(C-6)，16.3(C-27)，15.1(C-24)。以上数据与文献[16]基本报道一致，故鉴定为3β-羟基-乌苏烷-11-烯-13β，28-内酯。

化合物5白色粉末；ESI-MS：m/z489[M+H]+；1H NMR(400 MHz，C5D5N)δ：5.60(1H，s，H-12)，4.94(1H，dt，J= 11.0 Hz，H-2)，4.24(1H，d，J= 2.4 Hz，H-3)，3.71(1H，s，H-18)，1.69(3H，s，H-27)，1.59(3H，s，H-29)，1.37(3H，s，H-24)，1.06(3H，d，J= 6.5 Hz，H-25)，1.06(3H，s，H-26)，0.93(3H，s，H-30)，0.85(3H，s，H-23)；13C NMR(100 MHz，C5D5N)δ：181.4(C-28)，140.7(C-13)，128.7(C-12)，80.1(C-3)，73.4(C-19)，66.9(C-2)，55.3(C-18)，49.5(C-5)，49.0(C-17)，48.4(C-9)，43.6(C-14)，43.1(C-20)，42.9(C-1)，41.3(C-8)，39.6(C-4)，39.5(C-10)，39.4(C-22)，34.3(C-7)，30.2(C-23)，29.9(C-15)，27.8(C-29)，27.7(C-21)，27.1(C-16)，25.4(C-27)，24.8(C-11)，23.0(C-24)，19.4(C-6)，18.0(C-26)，17.5(C-25)，17.4(C-30)。以上数据与文献[17]报道基本一致，故鉴定为euscaphic acid。

化合物6白色粉末；ESI-MS：m/z521[M+H]+；1H NMR(400 MHz，C5D5N)δ：5.66(1H，br s，H-12)，5.12(1H，br s，H-6)，4.43(1H，d，J= 10.4 Hz，H-18)，4.28(1H，dd，J= 10.8，4.0 Hz，H-3)，4.09(1H，d，J= 10.4 Hz，H-2)，3.67(2H，d，J= 11.4 Hz，H-23a，23b)，1.85(3H，s，H-24)，1.78(3H，s，H-25)，1.71(3H，s，H-26)，1.62(3H，s，H-27)，1.21(3H，s，H-29)，1.14(3H，s，H-30)；13C NMR(100 MHz，C5D5N)δ：181.0(C-28)，144.4(C-13)，123.2(C-12)，81.4(C-18)，78.6(C-3)，69.3(C-2)，68.2(C-6)，66.4(C-23)，50.0(C-5)，49.4(C-9)，46.3(C-17)，45.1(C-19)，44.8(C-4)，42.9(C-14)，41.5(C-1)，41.2(C-7)，39.8(C-8)，38.6(C-10)，35.9(C-20)，33.9(C-22)，29.4(C-21)，29.3(C-15)，29.1(C-30)，28.4(C-16)，25.1(C-29)，24.6(C-27)，28.6(C-11)，19.0(C-26)，18.6(C-25)，16.1(C-24)。以上数据与文献[18]基本报道一致，故鉴定为2α,3β,6β,18β,23-pentahydroxy-olean-12-en-28-oic acid。

化合物7白色粉末；ESI-MS：m/z296 [M+H]+；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：8.01(1H，d，J= 16.0 Hz，H-4)，6.43(1H，d，J= 16.0 Hz，H-5)，5.84(1H，s，H-2)，3.85(1H，m，H-3′)，2.27(1H，ddd，J= 13.0，7.0，1.0 Hz，H-2′a)，2.09(3H，s，H-3)，1.91(1H，dd，J= 14.7，7.6 Hz，H-4′a)，1.85(1H，dd，J= 13.0，10.0 Hz，H-2′β)，1.74(1H，dd，J= 13.0，10.5 Hz，H-4′b)，1.35(3H，s，H-1′)，1.08(3H，s，H-5′)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：181.4(C-6′)，150.1(C-3)，133.6(C-4)，132.2(C-5)，121.6(C-2)，90.2(C-1′)，83.1(C-8′)，65.6(C-3′)，53.8(C-5′)，42.6(C-2′)，41.3(C-4′)，21.3(3-CH3)，18.8(1′-CH3)，14.9(5′-CH3)。以上数据与文献[19]报道基本一致，故鉴定化合物为rel-5-(3S,8S-dihydroxy-1R,5S-dimethyl-7-oxa-6-oxobicyclo-oct-8-yl)-3-methyl-2Z,4E-pentadienoic acid。

化合物8黄色固体；ESI-MS：m/z501 [M+H]+；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：5.90(1H，s，H-4)，5.72(1H，dd，J= 15.1，9.3 Hz，H-7)，5.57(1H，dd，J= 15.1，7.8 Hz，H-8)，5.32(1H，d，J= 1.5 Hz，H-1")，4.45(1H，m，H-9)，4.33(1H，d，J= 7.3 Hz，H-l′)，4.03(1H，d，J= 9.8 Hz，Hb-4")，3.87(1H，d，J= 1.5 Hz，H-2")，3.84(1H，dd，J= 12.2，2.4 Hz，Ha-6′)，3.69(1H，d，J= 9.8 Hz，Ha-4")，3.54～3.67(3H，Ha-6′，H-2，5")，3.35(1H，br t，J= 7.8 Hz，H-3′)，3.11(1H，m，H-5′)，2.70(1H，d，J= 9.3 Hz，H-6)，2.48(1H，d，J= 16.6 Hz，H-2b)，2.05(1H，d，J= 16.6 Hz，H-2a)，1.98(3H，s，H-13)，1.28(3H，d，J= 6.4 Hz，H-10)，1.03(3H，s，H-11)，0.99(3H，s，H-12)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：202.2(C-3)，169.7(C-5)，136.8(C-8)，130.9(C-7)，126.0(C-4)，103.7(C-1′′)，100.9(C-1′)，77.9(C-3′)，77.8(C-2′)，77.8(C-5′)，77.5(C-3′′)，75.0(C-4′′)，74.6(C-9)，74.5(C-2′′)，71.4(C-4′)，62.5(C-6′)，62.5(C-5′′)，56.5(C-6)，47.8(C-2)，37.2(C-1)，28.8(C-12)，27.3(C-11)，26.4(C-13)，21.7(C-10)。以上数据与文献[20]基本报道一致，故鉴定化合物为salvionoside B。

化合物9～11均为白色无定形粉末；ESI-MS：m/z457 [M+H]+、456 [M+H]+、427 [M+H]+，用两种不同溶剂系统展开，分别与齐墩果酸、白桦脂酸和α-香树脂醇对照品薄层色谱Rf值相同，经HPLC分析，分别与各对照品保留时间一致，依次确定化合物9为齐墩果酸，化合物10为白桦脂酸，化合物11为α-香树脂醇。

2.2 萜类化合物的抗炎活性

2.2.1 萜类化合物对RAW 264.7小鼠巨噬细胞活力的影响

MTT 试验检测11个萜类化合物分别在不同浓度时对 RAW 264.7 小鼠巨噬细胞活力的影响，结果如表1所示。

表1 11个萜类化合物对RAW 264.7小鼠巨噬细胞活力的影响

化合物1、3～9和11浓度在12.5～50.0 μmol/L范围内对RAW 264.7小鼠巨噬细胞增殖无明显抑制作用，化合物2和10显示有明显毒副作用。结果表明，除化合物2和10外，其他萜类化合物在12.5～50.0 μmol/L范围内对RAW 264.7小鼠巨噬细胞无细胞毒性，因此选取化合物1、3～9和11进行抗炎活性测试。

2.2.2 RAW 264.7小鼠巨噬细胞中NO 的含量

Griess 法检测9个萜类化合物抑制RAW 264.7细胞中NO的释放水平，结果如图2所示。

图2 9个萜类化合物对RAW 264.7小鼠巨噬细胞NO含量的影响Fig.2 The effect of nine terpenoids on NO production in RAW 264.7 mouse macrophages注：与空白组比较，##P<0.01；与LPS比较，*P<0.05，**P<0.01,***P<0.001。Note: Compared with control,##P<0.01;Compared with LPS,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.

LPS作用于RAW 264.7小鼠巨噬细胞后，细胞上清液中NO含量明显增加，与空白组比较，具有显著性差异(P<0.01)，说明模型诱导成功。与模型组比较，阳性药作用于细胞后，NO含量显著降低(P<0.001)。与模型组相比，广东紫珠中分离得到的9个萜类化合物均能不同程度地抑制NO释放，其中化合物3和9抑制能力尤为显著(P<0.001，P<0.01，P<0.05)。实验结果表明化合物3和9具有显著的抗炎活性，且三萜类化合物(3～6、9和11)抗炎活性优于倍半萜类化合物(7和8)，对比三萜类化合物结构发现，推测三萜类化合物中3位羟基取代和28位羧基取代会协同增强抗炎活性。

3 讨论与结论

本实验从广东紫珠地上部分的甲醇提取物中低极性部位中分离鉴定了11个萜类化合物，其中三萜类成分9个，倍半萜类成分2个。其中，化合物1、2和10为羽扇豆烷型，化合物6和9为齐墩果烷型，化合物3～5和11为乌苏烷型，化合物7为倍半萜内酯类，化合物8为降倍半萜类。本文首次从马鞭草科紫珠属植物分离得到E环开裂的三萜类化合物swinhoeic acid，查阅文献发现其研究报道较少，分布在蔷薇科的悬钩子属、蔷薇属、无尾果属和委陵菜属植物中，广东紫珠中该化合物的首次发现对于从化学结构分类学角度探讨植物的归属具有重要的指导意义。在化学成分分离的基础上，采用LPS诱导的RAW 264.7小鼠巨噬细胞建立体外炎症模型对11个萜类化合物进行抗炎活性测试。细胞增殖实验结果表明：在12.5～50 μmol/L范围内，化合物2和10对细胞增殖有显著抑制作用，其余萜类化合物对细胞增殖无明显抑制作用。随后选取化合物1、3～9和11进行抗炎活性测试，结果表明化合物3和9具有显著的抗炎活性，三萜类化合物3位羟基取代和28位羧基取代是化合物发挥抗炎活性的关键因素。研究结果为广东紫珠萜类成分抗炎机制的深入探讨提供了思路，并为广东紫珠在抗炎方面的临床应用提供了实验依据。