殷丛培, 吴 盟, 王志博, 高玉坤, 任根增, 杨溥原, 崔江慧, 常金华
(河北农业大学农学院;华北作物种质资源研究与利用教育部重点实验室,保定 071000)
高粱[Sorghumbicolor(L.)Moench]是我国主要的粮食、饲料和酿造作物[1],在新型农业发展和乡村振兴中具有重要的开发潜力[2]。高粱籽粒不仅含有丰富的淀粉、脂肪和蛋白质等营养物质,还含有大量的黄酮类化合物,可作为黄酮类化合物提取的重要原料[3]。黄酮类化合物有较强的生理活性、药用价值和抗氧化能力,且具抑菌抗癌、抗过敏、抗病毒、降低胆固醇、降血压和预防心血管疾病等功效[4],在食品、化妆品和保健品生产中也有着至关重要的作用[5]。因此,研究高粱籽粒中黄酮类化合物的变化对高粱开发利用具有重要意义。
黄酮类化合物的种类和含量主要受基因型和生长环境的影响[6],其含量和积累特性直接影响植物的色泽、品质及营养价值[7]。王安虎等[8]研究荞麦(FagopyrumesculentumMoench.)不同生育时期和不同器官中黄酮类化合物发现,叶片和茎中黄酮类化合物呈现先升高再降低的趋势,种子中黄酮含量最高。对谷子(Setariaitalica)[9]不同品种黄酮类化合物含量的测定发现,不同颜色籽粒的黄酮类化合物含量存在很大差异,其含量直接影响谷子的品质。Wu等[10]研究了不同高粱品种在不同灌溉条件下酚类及黄酮类化合物的含量变化,发现水分胁迫可显著提高黄酮物质的含量。
高粱种质资源变异类型丰富,籽粒颜色多样,不同种质间的黄酮类化合物种类和含量差异大[11]。目前,已经建立了高粱黄酮类化合物提取工艺和测定方法[12],在高粱糠、颖壳和麸皮中已分离鉴定出柚皮素、木犀草素、芹菜素和甘草酚等黄酮类化合物[13-15],但对高粱籽粒中黄酮类化合物积累特性仍鲜有报道。本研究采用HPLC测定了高粱种质的籽粒在发育过程中黄酮类化合物的含量,并分析黄酮类化合物在籽粒发育过程中的含量差异、积累特性及与颜色和品质的相关性,为高粱黄酮类化合物含量的测定、种质资源鉴定、专用品种选育与深加工等研究提供参考。
本研究选取26份高粱种质(表1),于2020年5月和2021年5月种植于河北农业大学育种中心(115°39′E, 38°81′N),小区采用完全随机排列,行距60 cm,株距20 cm,每份种质种植10行,每行20株,重复3次。在开花后10 d(T1)、17 d(T2)、24 d(T3)、31 d(T4)和38 d(T5)进行取样,将采集的籽粒用锡箔纸包裹后放置-80 ℃条件下保存,备用。
表1 供试高粱种质
儿茶素、异鼠李素、表茶儿素、槲皮素、柚皮素、芦丁、木犀草素、芹菜素和山奈酚标准品;甲醇、甲酸、乙腈、亚硝酸钠、六水合氯化铝、氢氧化钠。
Epoch2酶标仪,15A481超声清洗机,Agilent 1260高效液相色谱仪,ZORBAX SB-C18色谱柱(5 μm,4.6×250 mm),DAD检测器,Neofuge 15R高速冷冻离心机,Perten DA7250近红外谷物分析仪,FD-1C-50冷冻干燥机,XDN100-2氮吹仪,KONICA MINOLTA CR-10 Plus色差仪,GR150A研磨机。
1.3.1 品质的测定
采用近红外谷物分析仪测定籽粒中的淀粉、蛋白质和脂肪含量。
1.3.2 籽粒颜色的测定
在最后一次样品采集时(T5)选取完好无损的籽粒,利用色差仪测定种皮的色度值,每份高粱种质重复测定5次,测定L、a和b值,并计算Hue和Chroma 值[16]。
1.3.3 黄酮类化合物的提取制备
参照Ti等[17]的方法,将样品冷冻干燥后研磨成粉,称取1 g粉末与15 mL的4 ℃酸化甲醇提取液(95%甲醇与1 mol/L HCl的体积比=85∶15),混匀,4 ℃条件下振荡提取10 min后离心10 min,取上清液,重复提取3次,合并上清氮吹至无水状态。用80%的甲醇溶液溶解,定容至10 mL,采用0.22 μm滤膜过滤后储存在小棕瓶中,-20 ℃备用。
1.3.4 总黄酮含量的测定
采用Hossain等[18]的方法略作改进,以芦丁为标准品,绘制标准曲线:y=0.942 6x+0.048 6,相关系数R2=0.999 3,依据标准曲线计算样品中总黄酮的含量,结果以mg/100 g为单位。
1.3.5 HPLC标准品制作
将黄酮类化合物标准品溶于80%甲醇,配制质量浓度为10 mg/mL的标准品母液。基于母液分别配制0.1、0.2、0.4、0.8、1 mg/mL的工作液和标准品混合工作液。按HPLC条件分别检测不同浓度条件下标准品的滞留时间和色谱峰,并构建浓度与峰面积的标准曲线。
1.3.6 HPLC检测条件
色谱柱:ZORBAX SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相A(2%甲酸)和流动相B(乙腈),梯度洗脱条件:0~30 min(A:95%~75%),30~50 min(A:60%),50~60 min(A:95%),后运行5 min,流速0.8 mL/min,柱温40 ℃;进样量为10 μL;检测波长:280、320、360 nm。重复3次。
利用标准品浓度与峰面积的标准曲线计算各样品质量浓度,单位为μg/100 g。用SPSS 25.0软件做方差分析及相关分析,用Excel和R作图。
通过分析了不同种质高粱籽粒发育过程中总黄酮含量的变化,绘制总黄酮含量热图(图1),不同种质高粱籽粒中总黄酮含量及在发育过程中的积累特性均存在差异,除16矮、623B和6-5B外,大多数品种均呈下降趋势。高粱蔗的总黄酮含量最高,冀早糯1号和Han5-4次之,河农16、冀酿饲1号、623B和苏丹的总黄酮含量最低。
图1 高粱籽粒发育过程中总黄酮含量热图
按籽粒颜色不同,将高粱籽粒颜色划分为白、黄、橙、红和褐5个色系(表1)。利用色差仪测定高粱籽粒的色度值,随着L值的增大,种皮的颜色逐渐变浅,其中白色籽粒的L值最大,褐色籽粒的L值最小;a值的增大,籽粒颜色由浅红色变为深红色;b值的增大,颜色由浅黄转变为深黄色(表2)。
表2 高粱籽粒颜色指标的统计分析
在280 nm(儿茶素、表儿茶素、柚皮素)、320 nm(芹菜素)和360 nm(木犀草素、芦丁、槲皮素、山奈酚和异鼠李素)色谱条件下对高粱籽粒中黄酮类化合物进行定性和定量分析发现,种质类型、发育时期之间以及种质类型与时期间互作均表现出极显著差异(表3),表明黄酮类化合物含量不仅受基因型的影响,同时发育时期对黄酮类化合物的积累也存在显著影响。在T3时期1287中儿茶素含量显著高于其他品种(图2),为7 323.67 μg/100 g,211中表儿茶素显著高于其他品种,为8 462.65 μg/100 g;在T1时期1197中柚皮素含量显著高于其他品种,为691.44 μg/100 g,16矮、河农16、冀粮饲1号、1328、1138和226在发育过程中均未检测到柚皮素;在T4时期Han20-2中木犀草素显著高于其他品种,为235.43 μg/100 g;Han6-8和H54芹菜素在T5时期差异显著高于其他品种,冀粮饲1号在发育过程中未检测到芹菜素;槲皮素在T5时期Han20-2中含量显著高于其他品种,为433.64 μg/100 g;在T5时期Han6-8中山奈酚显著高于其他品种,为309.34 μg/100 g,河农16、冀粮饲1号、Han6-3、1138、1257、千三、高粱蔗和苏丹中均未检测到山奈酚;在T5时期Han20-2的异鼠李素显著高于其他品种,为94.50 μg/100 g,16矮、冀早糯1号、Han4-8、农大红2号、河农16、冀粮饲1号、Han6-3、1138、1257、6-5B、农大红1号、高粱蔗、苏丹和6-4中均未检测到异鼠李素;芦丁在T4时期Han20-2中含量显著高于其他品种,含量为24.46 μg/100 g。分析结果表明,白色籽粒高粱种质9种黄酮化合物含量均较低或未检出。
图2 高粱籽粒发育过程中黄酮类物质含量堆叠图
表3 高粱籽粒黄酮类化合物的方差分析
为了更好地探索不同高粱种质间黄酮类化合物的差异性,基于籽粒的黄酮类化合物含量和颜色,采用欧氏距离对不同高粱种质进行了聚类分析(图3a)。在距离为15处,将26份高粱种质分为3大类,第Ⅰ类包括冀粮饲1号、623B、苏丹、韩6-3、1138、6-5B和河农16,籽粒颜色均为白色且黄酮类化合物含量较低。第Ⅱ类包括冀早糯1号、高粱蔗、1287、Han4-8、Han6-8、Han4-3、6-4、16矮、千三、农大红一号、Han1-8、Han20-2和Han5-4,籽粒颜色较深大部分为橙色和红色,且芦丁、儿茶素、槲皮素、芹菜素、山奈酚、异鼠李素和木犀草素含量较高。第Ⅲ类包括1257、226、农大红2号、1328、1197和211,这些材料遗传背景相似,籽粒颜色较深,大部分为橙色,表儿茶素和柚皮素含量较高。
图3 高粱种质聚类分析图
对不同高粱种质进行主坐标(Principal Co-ordinates Analysis,PCoA),将26份高粱种质很好的分离,第一主成分和第二主成分的贡献率分别为45.89%和19.26%。PCoA分析同样将所有供试材料分为3组:A组主要包括在 PC1负半轴和PC2负半轴区域分布的9份种质,除了欧氏距离聚类第Ⅰ类中的7份种质,还包括Han4-8和6-4;B组主要包括PC2正半轴区域的种质,包含聚类第Ⅱ类中11份种质;C组主要包括在PC1正半轴区域的种质,除了聚类第Ⅲ类的种质,还有16矮。主成分分析结果与聚类分析的分类结果有较好一致性。
基于聚类分析结果(图3),分析了不同种质高粱黄酮类化合物在籽粒发育过程中的积累特性。各类表儿茶素和儿茶素均表现为先上升后下降的趋势,表儿茶素在第Ⅰ类种质中的积累最高峰出现在开花后17 d,在第Ⅱ类和第Ⅲ类的中最高峰在开花后的24 d;3类种质的儿茶素积累最高峰分别出现在花后17 d、24 d和31 d;芦丁变化趋势在第Ⅰ类种质中表现为先升高再下降,最高峰出现在花后24 d,而第Ⅱ类和第Ⅲ类的变化趋势为升高-下降-升高-下降的“M”型,且最高峰在花后17 d;槲皮素和山奈酚在籽粒发育过程中为上升的趋势,3类种质最高峰都在花后38 d;芹菜素在第Ⅰ类和第Ⅱ类种质中的变化趋势为整体上升,最高峰在花后38 d,第Ⅲ类为下降-上升的趋势,最高峰在花后10 d;异鼠李素在3类种质中积累特性不尽相同,第Ⅰ类为下降趋势,最高峰在花后10 d,第Ⅱ类为持续上升趋势而第Ⅲ类为上升-下降-上升的变化,且最高峰均在花后38 d。木犀草素含量在第Ⅰ类种质中为持续上升的趋势,最高峰在花后38 d,而在第Ⅱ和Ⅲ类高粱种质中为先升高再下降,最高峰在花后31 d。柚皮素在3类种质中均为下降的趋势,最高峰在花后10 d。因此,黄酮化合物的积累动态变化大致可以分为3种类型,第1种为升高-下降的变化趋势,主要有儿茶素、表儿茶素和芦丁;第2种为整体上升趋势,主要包括槲皮素、芹菜素、山奈酚、异鼠李素和木犀草素;第3种为整体下降的趋势,主要涉及柚皮素。可见,9种黄酮化合物在籽粒发育过程中的积累特性因基因型和颜色而异,尤其是籽粒颜色的深浅对黄酮类化合物积累的影响较大。
黄酮类化合物间的相关分析发现(图1b),木犀草素和芦丁均与儿茶素呈正相关,表儿茶素与柚皮素呈显著正相关(r=0.788,P<0.01),且儿茶素和表儿茶素与其他黄酮类化合物之间呈负相关;槲皮素和山奈酚均与柚皮素呈负相关,与其他黄酮类化合物间呈正相关;山奈酚、异鼠李素、木犀草素、芹菜素和芦丁均与槲皮素呈显著正相关,相关系数分别为0.719、0.928、0.635、0.564、0.682(P<0.01);芹菜素和异鼠李素均与山奈酚呈显著正相关,相关系数分别为0.920、0.719(P<0.01);木犀草素、芹菜素和芦丁均与异鼠李素呈显著正相关,相关系数分别为0.663、0.538、0.663(P<0.01);木犀草素与芦丁显著正相关(r=0.555,P<0.01)。9种黄酮类化合物与总黄酮之间都为正相关,其中儿茶素、芦丁和槲皮素与总黄酮的相关系数分别为0.575、0.657、0.416(P<0.01)。
测定供试材料籽粒的脂肪、淀粉和蛋白质的含量(表4),分析其与黄酮类化合物之间的相关性,表儿茶素和柚皮素均与脂肪呈正相关,其他黄酮类化合物皆为负相关;柚皮素、木犀草素和芦丁均与蛋白质呈负相关,其他黄酮类化合物皆为正相关;柚皮素与淀粉为负相关,其他黄酮类化合物皆为正相关,其中木犀草素和芦丁与淀粉的相关系数分别为0.391、0.476(P<0.05)。可见黄酮类化合物种类及含量对籽粒品质有显著影响。
表4 高粱籽粒中蛋白质、淀粉和脂肪含量
黄酮类化合物与高粱籽粒颜色指标相关性分析显示(图1b),Hue和L与黄酮化合物含量呈负相关关系,其中Hue与总黄酮呈显著负相关(r=-0.610,P<0.01);L指标与总黄酮、山奈酚和芹菜素之间呈显著负相关,相关系数分别为-0.611、-0.406和-0.466(P<0.05),通过逐步回归分析建立了回归方程L=48.55-0.082x1-0.007 23x2(x1:为芹菜素的含量;x2:为总黄酮的含量;R2=0.47),a指标与总黄酮含量之间呈显著正相关关系(r=0.534,P<0.01),说明黄酮类化合物含量越高,籽粒颜色就越深。Chroma与黄酮类化合物有一定的相关性,但相关性不显著。
籽粒中黄酮类化合物的含量受到基因型、籽粒颜色以及环境条件等的影响[6]。本研究发现高粱籽粒中黄酮类化合物的含量不仅取决于高粱基因型、籽粒颜色与发育进程也与其存在显著的相关性。Lee等[19]研究发现,深色籽粒的高粱中黄酮类化合物比白色籽粒的含量高,与本研究结果一致。在供试材料中,与白色籽粒种质相比,Han6-8籽粒为红色其芹菜素和山奈酚含量最高,Han20-2籽粒为黄色其木犀草素、异鼠李素、芦丁和槲皮素的含量最高。通过聚类分析发现黄酮类化合物含量最低的白色籽粒高粱种质聚为第Ⅰ类;籽粒颜色深(橙、红和褐色)的种质聚为第Ⅱ类,这类种质的芦丁、儿茶素、槲皮素和木犀草素等黄酮类化合物含量最高,这些结果与Wu等[10]、Dykes等[1]和Rooney[20]研究结果一致。第Ⅱ类种质可作为黄酮类化合物(儿茶素、槲皮素、芹菜素、山奈酚、异鼠李素和木犀草素)的提取和开发利用的首选种质资源。第Ⅲ类为亲缘关系较近的一组,这类材料的表儿茶素和柚皮素含量较高,表明基因型是决定黄酮类化合物种类及含量的重要因素之一,该类材料可用于表儿茶素和柚皮素的提取。高粱种质籽粒颜色与一些黄酮类化合物含量具有显著的相关性,同时与种质资源的来源也存在密切关系,这些黄酮类化合物可作为区分不同籽粒颜色和不同来源种质及其亲缘关系的生物标记物[21]。
不同植物、不同器官及不同发育阶段,黄酮类化合物的积累特性不同[22,23]。本研究发现,随着籽粒发育进程的推进,不同颜色籽粒高粱种质的黄酮类化合物的积累特性有所差异,但大多数黄酮类化合物表现为随发育进程的发展而下降的趋势。其中儿茶素、表儿茶素和芦丁表现为先升高再下降的变化趋势,与孙健等[22]和王美丽[23]在葡萄(VitisviniferaL)和荔枝(LitchichinensisSonn.)中的研究结果相似;槲皮素、芹菜素、山奈酚、异鼠李素和木犀草素在高粱籽粒发育过程中虽含量不同,但变化趋势相似,均呈上升的变化规律。贺军与等[24]在大麦(HordeumvulgareL.)籽粒发育进程黄酮类化合物的积累特性中研究发现,影响大麦籽粒中黄酮类化合物相对含量的因素主要包括籽粒质量增速(主要是淀粉含量增速)、化合物合成效率和衰减效率(降解速率和转化速率),本研究也发现黄酮类化合物的变化与高粱籽粒中的淀粉、蛋白质等的积累存在协同变化趋势,最终会影响到籽粒品质。高粱籽粒中黄酮类化合物的含量因籽粒发育进程而异,如柚皮素、芦丁和木犀草素的最高含量出现在花后10、17、31 d。槲皮素和山奈酚的适宜取样期均在成熟期,儿茶素、表儿茶素、芹菜素和异鼠李素积累的最高峰因种质而异,其适宜的取样期可根据高粱类型的不同而不同。因此,在高粱籽粒黄酮类化合物积累机制与生理功能研究中,应根据不同化合物的积累特性,确定样品的采集时期。
在高粱籽粒发育过程中黄酮化合物之间存在一定的相关性,绝大多数都呈显著正相关,这与黄酮类化合物的合成代谢通路有关[25]。黄酮类化合物通过一系列酶促反应合成,首先是苯丙氨酸转化为柚皮素,再由柚皮素经一系列的酶促反应转化为其他的黄酮类化合物。本研究中高粱籽粒中柚皮素的含量在籽粒发育过程中持续下降,其他化合物呈现不同程度的上升趋势,且表儿茶素、儿茶素和柚皮素与其他黄酮类化合物之间为负相关,说明随着籽粒发育进程的推进,其他黄酮类化合物的积累加速了柚皮素的转化。
籽粒颜色指标中L值与总黄酮、山奈酚和芹菜素均呈显著负相关,与刘战等[26]在芍药(PaeonialactifloraPall.)中的研究结果一致。西瓜[Citrulluslanatus(Thunb.)Matsum.& Nakai]果实番茄红素含量与西瓜果实颜色系数中Chroma、a、b值存在极显著正相关[16],籽粒颜色可以作为籽粒中黄酮类化合物含量的生物标记。黄酮类化合物及其积累动态在生物对环境的应答中具有重要作用,在易发黑与不易发黑的山龙眼(HeliciaformosanaHemsl.)叶片中苯三醇或氢醌衍生代谢物含量间存在显著差异[27]。还有研究认为高粱籽粒中黄酮类化合物的含量与其抗性相关[28],本研究发现黄酮类化合物种类、含量的差异与高粱基因型和颜色均有显著的相关性。因此,高粱中黄酮类化合物的变化可作为不同高粱种质资源鉴定和的标记,也为进一步研究高粱籽粒营养特性及抗逆性提供了参考。
本研究旨在探索不同籽粒颜色的高粱种质在籽粒发育过程中黄酮类化合物的差异、积累特性及与粒色之间的关系。种质类型和籽粒发育时期均会影响黄酮类化合物的积累,其中1287中儿茶素含量较高,211中的表儿茶素含量较高,1197中柚皮素含量最高,Han6-8中的芹菜素和山奈酚含量最高,Han20-2中槲皮素、木犀草素、异鼠李素和芦丁含量最高。不同的黄酮类化合物积累最高峰也不尽相同,芦丁、儿茶素和表儿茶素积累最高峰在发育中期(花后17~31 d);异鼠李素、木犀草素、芹菜素、槲皮素和山奈酚最高峰都在花后38 d;柚皮素最高峰在花后10 d。不同类别的籽粒颜色和黄酮化合物的含量存在显著差异,籽粒颜色深的高粱种质中黄酮类化合物含量较高。在籽粒发育过程中儿茶素、表儿茶素和芦丁为先升高再下降的变化趋势;槲皮素、芹菜素、山奈酚、异鼠李素和木犀草素为持续上升的趋势;柚皮素为下降的趋势。颜色系数Hue和L与黄酮化合物含量呈负相关关系,Chroma值与儿茶素、表儿茶素、柚皮素和木犀草素之间呈正相关关系。