温经通脉法对奥沙利铂致外周神经毒性大鼠瞬时受体电位通道的影响

程 赟，包玉花

(江苏省肿瘤医院,江苏 南京 210000)

奥沙利铂作为第3代铂类抗肿瘤化疗药物，临床疗效较顺铂和卡铂更为突出，且具有毒副作用更少、抗癌谱更广的优势，在肝癌、结肠癌等消化系统肿瘤的辅助和姑息治疗中占据主要地位[1]。然而，奥沙利铂外周神经毒性(Oxaliplatin-induced neurotoxicity, OXIN)发生率高达85%～95%，且具有剂量相关性，常使化疗方案被迫更换至二线而影响患者生存[2]。由于其发生机制尚未明晰，现代医学针对OXIN尚无公认的有效药物，目前临床主要以抗氧化、提高疼痛阈值、营养神经等作为治疗思路[3]。在减轻化疗不良反应、缓解症状和延长患者生存期等方面，中医药具有其特色优势。中医理论中，OXIN属于“痹证”范畴，以寒凝血瘀、气血亏虚为病机特点，温经通脉法治以温经散寒、养血通脉、活血化瘀，临床应用可有效防治OXIN，缓解患者症状，但其作用机制不明。近年研究发现，奥沙利铂可通过增加瞬时受体电位(TRP)通道的敏化作用引发OXIN，其相关拮抗剂可预防OXIN所致的炎症和痛觉过敏，以TRPA1和TRPM8为主的5种TRP成为治疗OXIN的新靶点[4-5]。本实验采用奥沙利铂腹腔注射建立OXIN大鼠模型，以不同剂量温经通脉方灌胃干预，探讨其对OXIN大鼠背根神经节中TRP通道的影响，为其防治OXIN提供实验理论依据。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 SPF级雄性Wistar大鼠60只，体重(180±20)g，由南京医科大学提供，动物合格证号：SYXK(苏)2021-0065。于相对恒温(22±2)℃、恒湿(湿度75%)的SPF级实验动物房中饲养，室内保持12 h照明与黑暗交替。实验内容经江苏省肿瘤医院实验动物伦理委员会审核通过(20210527015)。

1.2实验药物及试剂 温经通脉法药物组方：当归12 g、黄芪9 g、桂枝9 g、白芍9 g、川芎6 g、细辛3 g、大枣 9 g、通草6 g、生甘草6 g，换算大鼠灌胃等效剂量为6.21 g/kg，以此作为低剂量，高剂量为12.42 g/kg；奥沙利铂购自江苏恒瑞医药股份有限公司，用5%葡萄糖溶解为终浓度1 mg/mL的溶液，置于4 ℃冰箱待用；甲钴胺注射液购自海南斯达制药有限公司。DMEM/F12 基础培养基、胎牛血清、胰蛋白酶购自Gibco公司；神经元特异性烯醇化物酶(NSE)抗体、FITC荧光标记IgG购自Sigma 公司，Hochest 33342染料购自Biosharp公司；TRPA1、TRPM8、TRPV1、TRPV2、TRPV4一抗购自Abcam公司；RT-PCR试剂盒购自ABI公司，引物由上海英骏生物技术有限公司提供。

1.3实验方法 60只Wistar大鼠适应性饲养1周后，按体重随机分为空白组、模型组、甲钴胺组、温经通脉低剂量组、温经通脉高剂量组，每组10只。模型组、甲钴胺组及温经通脉低、高剂量组大鼠均给予奥沙利铂4 mg/kg腹腔注射，每周的前2 d每天注射1次，连续注射4周，空白组大鼠给予等体积5%葡萄糖溶液腹腔注射。实验期间，甲钴胺组同时给予甲钴胺注射液0.135 mg/kg腹腔注射，2次/周(每周的前2 d)，连续4周；温经通脉低、高剂量组分别给予温经通脉汤剂6.21 g/kg、12.42 g/kg灌胃，1次/d，连续4周。

1.4观察指标

1.4.1大鼠一般情况及体重 实验期间每日观察各组大鼠饮食饮水、大小便、活动等情况，测定各组大鼠实验前及实验第7,14,21,28天的体重。

1.4.2大鼠机械性缩足阈值(MWT) 采用动态足底触觉仪分别于实验前及实验第7,14,21,28天测定各组大鼠MWT：将大鼠单独放置于有金属网格的透明测试笼，适应15 min待大鼠探究活动消失后，使用Von Frey纤维细丝刺激大鼠后肢双足足底中心，刺激压力从2 g开始逐渐增加，以200 g作为切断压力，大鼠出现抬足、舔足等动作为有反应，每只重复测量5次，每次刺激间隔5 min，5次中有3次及以上出现阳性反应则为有机械性痛敏，取测定力度的平均值即为大鼠MWT。

1.4.3大鼠背根神经节中TRPA1、TRPM8阳性表达情况 实验结束后各组随机选5只大鼠，经腹腔注射麻醉后采用10%福尔马林溶液行腹主动脉灌注，大鼠颈部僵硬后取L4～5段背根神经节，于10%福尔马林溶液中固定48 h，经乙醇脱水，二甲苯透明后制备5 μm石蜡切片。切片进行脱蜡，二甲苯透明，梯度酒精脱水，0.3%过氧化氢孵育20 min，再经抗原热修复，BSA封闭20 min，一抗4 ℃孵育过夜，二抗37 ℃孵育20 min，SABC 37 ℃孵育20 min，DAB显色，倒置光学显微镜于400倍下观察拍照。TRPA1和TRPM8阳性表达分布于胞质，呈棕黄色，采用Image J软件随机选取5个视野，计数TRPA1和TRPM8阳性细胞数量，取平均值。

1.4.4大鼠背根神经节细胞提取及鉴定 各组剩余5只大鼠同法取出L4～5段背根神经节后，放入含有1%青链霉素的PBS 缓冲液中，清洗表面血渍和多余组织后，用显微镊逐一摘取椎间孔中的神经节，放入预冷的DMEM/F12 常规培养基中，更换培养基，洗涤3遍后收集放入离心管，于1 400 r/min下离心5 min，小心弃去上清，加入0.25%胰蛋白酶于水浴锅中37 ℃消化20 min，每隔5 min晃动1次，随后于冰上轻柔吹打20 min，滴加胎牛血清以终止消化，1 400 r/min下离心5 min，弃去消化液后加入DMEM/F 12培养基制成细胞悬液，以2×105个/mL密度接种，于5%CO2、37 ℃恒温的培养箱中培养。取空白组大鼠背根神经节细胞，采用NSE免疫荧光法鉴定细胞：取对数期生长的背根神经节细胞接种于事先放入无菌盖玻片的6孔板中，培养至贴壁后按NSE试剂盒步骤避光染色，同时加入Hochest 33342 荧光染料染细胞核，甘油封片后于荧光显微镜下观察染色情况，NSE标记的细胞发绿色荧光，细胞核发蓝色荧光。

1.4.5大鼠背根神经节细胞中TRP通道蛋白表达检测 取各组对数生长期的背根神经节细胞，接种于6孔板，培养48 h后，加入裂解液于冰上裂解，提取细胞总蛋白，BCA 法测定蛋白浓度，蛋白样本于水浴锅中煮沸变性，经蛋白上样，凝胶电泳，PVDF转膜，5%封闭液封闭后，滴加一抗于4 ℃冰箱过夜，TBST 清洗，加入二抗，室温孵育2 h，洗膜，滴加ECL，化学发光系统曝光，以GAPDH为内参，用Image J 软件分析条带灰度值，计算TRPA1、TRPM8、TRPV1、TRPV2、TRPV4蛋白相对表达量。

1.4.6大鼠背根神经节细胞中TRP通道mRNA表达检测 取各组对数生长期的背根神经节细胞，接种于6孔板，培养48 h后提取细胞总RNA，紫外分光光度仪测定总RNA 浓度，将RNA反转录得到cDNA，以cDNA为模板，按RT-PCR试剂盒步骤检测TRPA1、TRPM8、TRPV1、TRPV2、TRPV4 mRNA表达情况。反应体系为20 μL，反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸15 s，共40个循环。以 GAPDH 作为内参，mRNA相对表达量采用2ΔΔCt方法计算。TRP通道各基因引物序列见表1。

表1 瞬时受体电位(TRP)通道各基因引物序列

2 结 果

2.1各组大鼠一般情况及体重比较 大鼠在注射奥沙利铂后出现行动迟缓、腹泻、进食减少、舔足、抬足活动等现象；各药物干预组灌胃后，大鼠行动较前活跃，进食、腹泻等情况逐渐恢复。模型组大鼠实验第14，21,28天的体重均明显低于同期空白组(P均<0.05)；温经通脉低、高剂量组和甲钴胺组大鼠实验第21,28天的体重均明显高于同期模型组(P均<0.05)，各药物组间比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

表2 空白组和奥沙利铂外周神经毒性造模各组大鼠体重比较

2.2各组大鼠MWT比较 空白组大鼠MWT较稳定，模型组大鼠实验第14,21,28天的MWT均明显低于同期空白组(P均<0.05)；温经通脉低、高剂量组和甲钴胺组大鼠相应时间点的MWT均明显高于同期模型组(P均<0.05)，各药物组间比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表3。

表3 空白组和奥沙利铂外周神经毒性造模各组大鼠机械性缩足阈值比较

2.3各组大鼠背根神经节TRPA1、TRPM8表达情况 免疫组化检测显示，空白组大鼠背根神经节中仅见少量TRPA1、TRPM8阳性表达；模型组大鼠背根神经节中TRPA1、TRPM8阳性表达增多，阳性表达量均明显高于空白组(P均<0.05)；温经通脉低、高剂量组和甲钴胺组大鼠背根神经节中TRPA1、TRPM8阳性表达减少，阳性表达量均明显低于模型组(P均<0.05)。见图1及图2。

图1 空白组和奥沙利铂外周神经毒性造模各组大鼠背根神经节中TRPA1、TRPM8阳性表达情况(免疫组化染色，×400)

图2 空白组和奥沙利铂外周神经毒性造模各组大鼠背根神经节中TRPA1、TRPM8阳性表达量

2.4大鼠背根神经节细胞鉴定情况 NSE免疫荧光染色显示，NSE在背根神经节细胞胞浆中表达，染色呈绿色荧光，Hochest染在细胞核中呈现蓝色荧光，两者融合后，计算出背根神经节纯度大于90%。见图3。

图3 免疫荧光染色鉴定大鼠背根神经节细胞(×400)

2.5各组大鼠背根神经节细胞中TRP通道相关蛋白表达情况 实验结束后，模型组大鼠背根神经节细胞中TRPA1、TRPM8、TRPV1、TRPV2、TRPV4蛋白相对表达量均明显高于空白组(P均<0.05)，温经通脉低、高剂量组和甲钴胺组大鼠各指标均明显低于模型组(P均<0.05)，各药物组间各指标比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图4。

图4 空白组和奥沙利铂外周神经毒性造模各组大鼠背根神经节细胞中TRP通道相关蛋白表达情况

2.6各组大鼠背根神经节细胞TRP通道相关mRNA表达情况 实验结束后，模型组大鼠背根神经节细胞中TRPA1、TRPM8、TRPV1、TRPV2、TRPV4 mRNA相对表达量均明显高于空白组(P均<0.05)，温经通脉低、高剂量组和甲钴胺组大鼠各指标均明显低于模型组(P均<0.05)，各药物组间各指标比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表4。

表4 空白组和奥沙利铂外周神经毒性造模各组大鼠背根神经节细胞中TRP通道相关mRNA相对表达量比较

3 讨 论

奥沙利铂作为恶性肿瘤一线化疗中的关键药物，所引起的周围神经病变也愈加受到关注。奥沙利铂致神经毒性分为急性和慢性两种形式，急性多为短暂、可逆的肌肉痉挛，感觉迟钝或异常；慢性则为持续的肢端对称性麻木，“手套、袜套样分布”，感觉障碍，肌力减弱，可伴有肌肉痛性痉挛、萎缩，自主神经损伤等，常导致治疗中断，影响患者生活质量和临床获益[6-7]。国内外针对此类不良反应已开展相关研究，但目前尚无明确有效药物。近年来，中医药的神经保护作用逐渐受到许多研究者的关注，应用中药复方可有效缓解化疗患者外周神经毒性，缩短症状持续时间，显示出中医疗法的特色与优势[8-9]。

结合OXIN手足麻木或疼痛，遇冷加重的临床特征，可将其归属于中医学“痹证”范畴。疾病本质为本虚标实，以气血亏虚为本，寒凝血瘀为标。恶性肿瘤患者机体功能较为低下，化疗后气血受阻，四末不荣，而致手足末端麻木、感觉异常；正气虚败，寒邪乘虚侵入则加重，更有血虚而筋肉不荣，以致肢体功能障碍[10]。温经通脉法方药组成中当归性甘温而入肝，其气轻而辛，既能温补肝经，养血和血，又可行血通经，使行中有补，补而不滞；黄芪甘温补益脾肺，固体表之卫气；桂枝辛温通经，散寒通痹；白芍养血和营，和血通经，既助当归调补营血，又与桂枝相和以调和营卫；川芎祛风活血，行气止痛；细辛辛温散寒，通达表里，内温脏而外温经，与桂枝同用以温阳除寒邪，畅通血脉；通草通经脉而畅血行；大枣、甘草健脾益气，调和诸药，重用大枣以助黄芪、当归、白芍益气补血之效，又可防桂枝、细辛燥烈伤及阴血；全方合用，使阴血充养，经脉通畅，手足温而客寒除。

本实验通过奥沙利铂腹腔注射建立OXIN大鼠模型，观察了温经通脉方灌胃干预的作用。结果显示，大鼠给予奥沙利铂后体重明显下降，出现腹泻等症状，MWT降低，而温经通脉法可增加大鼠体重及改善腹泻症状，提高大鼠MWT。提示温经通脉法可促进OXIN大鼠消化功能恢复和体重的增加，能有效提高OXIN大鼠的疼痛阈值。现代研究表明，Ca2+的超负荷在慢性OXIN发生过程中发挥重要作用，作为钙离子渗透性的TRP通道成为OXIN治疗的新靶点[11]。其中3种热敏TRP通道(TRPV1、TRPV2、TRPV4)和2种冷敏TRP通道(TRPA1、TRPM8)已确定在化疗所引起的神经性疼痛背根神经节中呈现高表达[12-13]。TRPA1和TRPM8可作为“冷传感器”导致机械痛增加，是诱发OXIN的主要因素[14]。相关实验研究表明，奥沙利铂可上调大鼠背根神经节中TRPA1和TRPM8的表达水平，通过敲除TRPA1和TRPM8基因或应用拮抗剂可减轻或消除OXIN所致的冷痛和痛觉过敏[15-17]；在大鼠背根神经节神经元中，奥沙利铂可通过激活TRPV1破坏神经元结构，从而增加外周神经敏感性[18]。此外，TRPV1和TRPA1在背根神经节神经元中有30%～50%共定位，二者在背根神经节通道的激活中发挥协同作用[19]。高温所诱导的外周神经元痛觉敏感中可见TRPV2 蛋白表达增多，在顺铂作用的背根神经节神经元中亦可见TRPV2 表达升高[20-21]。本实验免疫组化结果显示，OXIN大鼠背根神经节中可见TRPA1和TRPM8阳性表达明显增多，温经通脉法干预后二者阳性表达明显减少，提示温经通脉法可通过抑制TRPA1和TRPM8通道减轻OXIN。进一步检测大鼠背根神经节细胞中TRP通道的表达发现，OXIN大鼠背根神经节细胞中TRPA1、TRPM8、TRPV1、TRPV2、TRPV4蛋白和mRNA表达均明显增加，温经通脉法干预后均明显降低，表明温经通脉法可抑制OXIN大鼠背根神经节中TRP通道的激活。综上所述，温经通脉法可明显提高OXIN大鼠疼痛阈值，改善大鼠行为学改变，其作用机制可能与抑制大鼠背根神经节及背根神经节神经元中TRP通道的激活相关。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。