miR-615-5p通过IGF2/PI3K/AKT信号通路调控胃腺癌发生发展的作用机制

王雪君，王亚东，王慧敏，步雪峰

0 引 言

胃癌是最常见的消化系统恶性肿瘤,近年发病率不断上升,已成为危害健康的重要疾病[1]。近年来，虽然外科手术设备和辅助治疗方法取得了显著的发展，但由于胃癌患者发现时多为中晚期，手术后复发率较高，且总体5年生存率仍不高，预后较差[2]。所以发现新的早期诊断胃癌标志物对于控制胃癌发生和复发至关重要。非编码单链RNA(microRNA，miRNA)被发现与癌症的发生、发展和转移密切相关，有望成为胃癌诊断的重要标志物和新的治疗靶点，为胃癌患者生存期延长及改善预后带来了希望。miR-615-5p是近年来新鉴定的具有与癌症发展相关的内源性微小RNA(miRNA)[3]。胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factor-2, IGF2)是一种包含67个氨基酸的类似激素，不仅具有胰岛素样的代谢作用，同时属于胎儿生长因子,其在包括乳腺癌[4]、卵巢癌[5]、结直肠癌[6]和前列腺癌[7]等在内的不同恶性肿瘤组织中呈过表达。磷脂酰肌醇-3-羟激酶/丝苏氨酸激酶(phosphatidylinositol 3-hydroxykinase/seronine kinase,PI3K/AKT)信号通路在肿瘤的发生发展中发挥重要作用，很多治疗手段均可通过阻断该信号通路来提高肿瘤的治疗疗效[8]。本研究的目的为探讨miR-615-5p在胃腺癌中的表达水平及其通过阻断PI3K信号通路来抑制胃腺癌的机制，分析其在胃腺癌诊断、治疗中作为靶点的价值。

1 材料与方法

1.1 研究对象选取2019年11月至2020年12月至江苏大学附属人民医院普外科就诊的48例胃腺癌患者。所有胃腺癌患者病理类型均由术中及术后组织病理确诊，术前均未接受任何放、化疗。其中取距离胃腺癌组织外缘3 cm的组织作为癌旁正常组织，组织收取后，保存于液氮罐中运输至实验室-80 ℃冰箱，以备进一步使用。样本收集均得到患者知情同意并签署了知情同意书，且通过了江苏大学附属人民医院伦理委员会批准(批准号：K-20160030-Y)。

1.2细胞株和主要试剂人胃腺癌细胞系BGC、HGC、MGC和人胃黏膜上皮细胞株(GES)来自南京凯基生物公司。胎牛血清、RPMI 1640培养液及胰蛋白酶购自美国Gibco公司；miR-615-5p mimics、miR-615-5p inhibitor及相应阴性对照、si-IGF2均由广州锐博生物技术有限公司设计合成； PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；LipofectamineTM 2000转染试剂、Trizol试剂购自美国Thermo Fisher Scientific公司；逆转录试剂盒及实时荧光定量 PCR 试剂盒购于日本TaKaRa公司；Transwell小室购自美国康宁公司；兔抗mTOR抗体、兔抗PI3K抗体及兔抗IGF2抗体均购自武汉博士德生物工程有限公司，兔抗β-Actin抗体、兔抗AKT抗体及羊抗兔二抗均购自武汉三鹰生物技术有限公司。

1.3方法

1.3.1 细胞培养及转染复苏细胞培养在含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，置于37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中。1 d左右可更换细胞培养液，当细胞生长状态较良好且密度达到80%左右可进行细胞传代。将HGC及MGC细胞分别接种于2个6孔板中，HGC板设置过表达组(miR-615-5p mimics)及相应阴性对照， MGC板设置敲减组(miR-615-5p inhibitor)及相应阴性对照。当细胞覆盖率达70%时，加入Lip2000转染试剂、培养基等预制好的转染复合物进行转染，并用qRT-PCR检测干扰效率。

1.3.2实时荧光定量PCR(qRT-PCR)用Trizol法提取组织及细胞中的总RNA，采用Nanodrop2000微量分光光度计检测总RNA的浓度和纯度后，再利用逆转录试剂盒将所提取的总RNA进行逆转录为cNDA。用实时荧光定量PCR仪来扩增cNDA以检测miR-615-5p及IGF2在组织及细胞中的相对表达量。该扩增的扩增体系为：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30s，一共40个循环。用2-△△CT法计算目的基因的相对表达量。每个实验独立重复进行3次，每个样品均设置3个复孔。U6上游引物5′-GGAACGATACAGAGAAGATTAGC-3′，下游引物序列为5′-TGGAACGCTTCACGAATTTGCG-3′；miR-615-5p的上游引物序列是5′- GGGGGTCCCCGGTGCT-3′，下游引物序列为5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′；GAPDH上游引物5′-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′，下游引物序列为5′-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3′；IGF2上游引物5′-CTGGAGACGTACTGTGCTAC-3′，下游引物序列为5′-CATATTGGAAGAACTTGCCCAC-3′。

1.3.3平板克隆形成实验将转染后的HGC和MGC细胞接种于6孔板中(每孔1000个细胞)，置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中孵育。每3-4天更换培养基1次，两星期后肉眼可见克隆团时终止培养。吸净细胞上层培养基，PBS轻轻冲洗3遍，将4%的多聚甲醛以1 mL/孔加入6孔板中，并置于4 ℃冰箱固定30 min，再用PBS清洗3遍，将 0.1%的结晶紫染液以1 mL/孔加入6孔板中染色30 min，最后用双蒸水清洗至背景干净，室温下放置到干燥状态，计数克隆形成数。实验重复3次，取平均值。公式如下：

克隆形成率(%)=(克隆数/接种细胞总数)×100%

1.3.4细胞划痕实验将HGC和MGC细胞分别接种于6孔板中，按照分组进行干预，当细胞覆盖率达80%左右时，用10 μL的无菌移液枪头在每个孔中间纵方向各划“一”直线，用PBS冲洗3遍直至不再有脱落的细胞漂浮，并更换为无血清的培养基，拍照并记录为0 h, 然后置于培养箱中继续培养，并在24h时再次拍照记录宽度，随机选择5个视野测量细胞愈合率，实验重复3次，取平均值。公式如下：

细胞愈合率(%)=(0 h划痕宽度-24 h划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%

1.3.5Transwell迁移实验消化干预后的HGC和MGC细胞后，用无血清培养基重悬细胞，在Transwell小室上层中加入100 μL，然后在下层小室中每孔加600 μL含有10%血清的培养基，置于含37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中培育24 h。用镊子取出小室，并弃去其中的培养液，用棉签轻轻擦拭小室上层内侧未迁移的细胞，用PBS清洗3次，移到预先加入了600 μL的4%多聚甲醛溶液的孔中浸泡细胞并进行固定，半小时后去除多聚甲醛，取出小室，吸干上室固定液，PBS再次清洗3次，用0.1%的结晶紫染液染色30 min，PBS洗干净后再次用棉签轻轻擦拭上室，晾干，显微镜下拍照，取5个随机视野计数，实验重复3次。

1.3.6蛋白质印迹法在干预24 h后的HGC和MGC细胞中加入1 mL/孔配制好的RIPA裂解液，在冰上裂解15 min，用细胞刮刀将细胞刮下，吸入2 mL离心管中，置于煮沸的开水中10 min，离心后吸取上清。再进行10%的SDS-PAGE凝胶电泳，恒流350 mA、120 min进行转膜，然后在室温下用5%的脱脂奶粉封闭2 h, 再将一抗(兔抗β-Actin 1∶5000，兔抗IGF2 1∶500，兔抗mTOR 1∶500，兔抗PI3K 1∶500，兔抗AKT 1∶500)置于4 ℃冰箱孵育过夜，第2天，取出条带，用TBST清洗3次，每次10 min，再在室温下用羊抗兔二抗(1∶5000)孵育条带2 h，再次用TBST清洗3次，每次10 min，最后予以ECL化学发光显影。使用Image J软件对条带进行半定量分析。

2 结 果

2.1 miR-615-5p在胃腺癌患者组织和癌旁正常组织中的表达水平miR-615-5p在胃腺癌组织中的表达量明显低于癌旁组织[(0.42±0.22)%vs(1.31±0.85)%，P<0.01]。

2.2 miR-615-5p在胃腺癌细胞株中的表达水平miR-615-5p在3株胃腺癌细胞HGC、MGC、BGC的表达水平均明显低于正常胃黏膜上皮细胞GES(P<0.05)，见图1。在3种胃腺癌细胞中HGC中的miR-615-5p表达水平最低，在MGC中的表达水平相对较高，故后续以这两种细胞进行后续的转染以及生物功能学实验。

与GES比较，*P<0.05

2.3 miR-615-5p的表达水平对胃腺癌细胞的增殖有影响克隆形成实验显示，HGC中miR-615-5p mimics组的克隆形成率明显低于miR-615-5p NC组[(5.33±1.04)%vs(24.33±4.04)%,P<0.01]；MGC中组miR-615-5p inhibitor的克隆形成率明显高于miR-615-5p NC组[(58.37±3.56)%vs(31.43±2.97)%,P<0.01]。

2.4 miR-615-5p的表达水平对胃腺癌细胞的迁移有影响细胞划痕实验表明，胃腺癌细胞HGC中miR-615-5p mimics组的迁移率[(47.33±2.08)%]明显低于miR-615-5p NC组[(83.33±4.72)%]；MGC中miR-615-5p inhibitor组的迁移率[(79.80±3.86)%]明显高于miR-615-5p NC组[(32.17±4.80)%]，差异具有统计学意义(P<0.01)，见图2。Transwell实验表明，胃腺癌细胞HGC中miR-615-5p mimics组的迁移细胞数(98.33±8.62)明显低于miR-615-5p NC组(206.30±15.82)；MGC中miR-615-5p inhibitor组的迁移细胞数(295.00±10.44)明显高于miR-615-5p NC组(194.7±12.66)，差异具有统计学意义(P<0.01)。见图3。

a:HGC中;b：MGC中

a、c:miR-615-5p NC组；b、d:miR-615-5p mimics组

2.5IGF2和miR-615-5p共同作用影响胃腺癌的发生发展通过生物信息学预测到IGF2是miR-615-5p的潜在靶基因， miR-615-5p可以结合IGF2的3′UTR，见图4。同时通过生物信息学预测IGF2的Kaplan-Meier生存曲线，预测miR-615-5p的敲减与胃癌患者预后不良相关。见图5。miR-615-5p mimics组较NC组IGF2表达量下降； miR-615-5p inhibitor 组较NC组IGF2表达量增加，差异有统计学意义(P<0.01)。见图6。

图4 生物信息学预测miR-615-5p与IGF2的3′UTR互补核苷酸序列

图5 IGF2表达的胃癌患者的Kaplan-Meier生存曲线(P=1.4e-11)

*P<0.01

2.6miR-615-5p的表达水平对IGF2蛋白及PI3K/AKT信号通路的影响蛋白质印迹实验显示，胃腺癌细胞HGC中miR-615-5p mimics组的IGF2、PI3K、AKT、mTOR蛋白的表达明显低于miR-615-5p NC组；MGC中miR-615-5p inhibitor组的IGF2、PI3K、AKT、mTOR蛋白的表达明显高于miR-615-5p NC组，差异具有统计学意义(P<0.01)。在胃腺癌细胞MGC中，共转染miR-615-5p inhibitor及si-IGF2后，IGF2、PI3K、AKT、mTOR蛋白的表达水平均可被逆转，差异具有统计学意义(P<0.01)。见图7。

a：miR-615-5p mimics、inhibitor、 NC转染24 h;b：miR-615-5p inhibitor、NC及miR-615-5p inhibitor+si-IGF2转染24 h

3 讨 论

近年来大量研究显示， miRNA在真核生物中广泛存在，其可通过靶向其靶基因的表达参与调控肿瘤细胞的增殖、凋亡等恶性表型，是肿瘤治疗的潜在分子靶点[9]。2007年， Landgraf 等[10]对哺乳动物全基因组miRNA文库测序时发现了miR-615。迄今为止，miR-615-5p作用和机制报道并不多见，国内外报道多集中于对肝癌、胰腺癌、乳腺癌和肺癌等癌症的调控作用的研究[11-14]。虽然miR-615-5p在其他肿瘤中研究较多，但在胃癌中尚不完善。

本研究中，miR-615-5p在胃腺癌患者组织低表达，在胃癌细胞系中低表达，但在GES 细胞系中表达较高。因为胃癌和胃癌细胞系具有低水平的miR-615-5p表达，我们提出了一个假设，miR-615-5p可能作为一个抑癌基因在胃癌细胞的发展中发挥重要作用。随后，我们选择miR-615-5p表达量最低的HGC细胞进行过表达，表达量相对较高的MGC细胞进行敲减。通过一系列细胞功能学实验后，我们发现，过表达miR-615-5p后可明显抑制胃腺癌细胞的增殖和迁移；敲减miR-615-5p后则可促进胃腺癌细胞的增殖和迁移。由此可推测，miR-615-5p可抑制胃腺癌的发生和发展。

为了进一步探索miR-615-5p靶向的生物学功能的详细机制，我们通过生物信息学预测了miR-615-5p可能影响的若干靶点，发现了IGF2蛋白为其中一个靶点，并将其作为候选靶点。胰岛素样生长因子2 (insulin like growth factor 2,IGF2) 是最早发现的内源性印迹基因, 是一种多功能细胞增殖调控因子,根据以往报道可知，IGF2可与细胞生长发育、血管生成有关，并且具有抗凋亡作用[15]。IGF2具有促进细胞有丝分裂、胚胎形成及产后生长发育等作用。在生理条件下，对胚胎正常发育有促进作用，在病理条件下，可发挥促进肿瘤增殖生长的作用[16]。

我们通过蛋白质印迹法，检测了IGF2的蛋白表达水平，过表达miR-615-5p后IGF2蛋白表达明显减少；而敲减miR-615-5p后IGF2蛋白表达增加。由此推测miR-615-5p可能通过调节IGF2在胃腺癌细胞中发挥抑癌作用。先前的研究证实，PI3K/AKT/mTOR通路对多种肿瘤类型的细胞增殖、血管生成、代谢和治疗抗性具有关键影响[17]。此外，IGF2与PI3K/AKT/mTOR通路相关，IGF2过表达可促进肿瘤转移和进展，从而导致各种癌症的治疗失败甚至死亡[18]。本研究还发现，转染miR-615-5p mimics可抑制胃腺癌细胞中的PI3K、AKT、mTOR的蛋白表达水平，转染miR-615-5p inhibitor可促进胃腺癌细胞中的PI3K、AKT、mTOR的蛋白表达水平。这表明了miR-615-5p可能抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路。为了进一步探究IGF2对胃腺癌中PI3K/AKT/mTOR通路的影响，对共转染miR-615-5pinhibitor及si-IGF2的MGC细胞进行了蛋白质印迹分析，结果表明，与敲减miR-615-5p相比，IGF2蛋白及PI3K、AKT、mTOR蛋白的表达水平可被逆转。这些结果提示：在胃腺癌细胞中，miR-615-5p可以通过IGF2/PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制胃腺癌的侵袭与转移。

综上所述，miR-615-5p在胃腺癌组织和细胞中低表达，可能通过直接靶向IGF2阻断PI3K/AKT/mTOR信号通路而在胃腺癌中发挥肿瘤抑制作用，为胃腺癌的预后和治疗提供新的理论基础。