基于网络药理学的灯银脑通胶囊治疗脑卒中的有效成分群及关键靶点预测*

丁 梦,何帅兵,强伟杰,辜升亮,胡振波,黄 斌,邢小燕△,孙晓波△

1贵州中医药大学药学院,贵阳 550025

2中国医学科学院药用植物研究所,药理毒理中心,北京 100193

3浙江省湖州师范学院,医学院、护理学院,基础部,湖州 313000

4昆药集团股份有限公司,昆明 650106

脑卒中是一种发病率较高的脑血管疾病,除引起局灶性脑功能缺陷,如认知功能障碍和肢体功能损伤之外,还会导致疲劳、睡眠障碍、焦虑和抑郁等精神症状[1]。脑卒中分为缺血性脑卒中(cerebral ischemic stroke,CIS)和出血性脑卒中,其中CIS占脑卒中疾病的85%,可由于神经元缺氧和能量供应不足导致不可逆的神经元损伤和脑组织损伤[2]。近年来对脑卒中的治疗主要采用溶栓类、抗凝类和神经保护类药物,均具有良好的效果。

灯银脑通(DYNT)为彝族名医经验方剂,由灯盏细辛、银杏叶、三七、满山香四味药组成。其中含量较高的化学成分包括灯盏乙素、银杏内酯A、银杏内酯B、白果内酯、人参皂苷Rg1和三七皂苷R1。因其具有行气活血、散瘀通络的功效,故临床上可用于治疗缺血性脑卒中[3]。目前对灯银脑通胶囊的研究较少,相关研究发现其药理作用主要集中在促智、抗抑郁、降血脂三个方面[4-6]。另有研究发现,DYNT在脑卒中恢复期和后遗症期的治疗,以及认知功能障碍和脑微循环上有一定的作用[7]。

网络药理学的研究思路是将药物靶点和疾病相关靶点共同映射于生物分子网络,以生物分子网络为基础建立药物与病证的关联机制[8]。网络药理学研究具有系统性、关联性和预测性等特点,被广泛应用于科学研究[9]。本研究通过网络药理学的方法将DYNT化学成分与脑卒中疾病很好地关联起来,结合人工智能算法预测DYNT治疗脑卒中的有效成分群、信号通路与靶点,为进一步研究DYNT治疗脑卒中的作用机制提供理论支持。

1 研究方法

1.1 数据来源

1.1.1 DYNT化学成分的收集 基于中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)[10]、中医药研究综合数据库(TCMID)[11]和TCM-Mesh[12]三个中草药数据库,收集DYNT的化学成分。在网络药理学研究过程中,以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)和类药性指数(drug-likeness,DL)为参考指标,其阈值设定为15%和0.18,将同时满足以上两个条件的化合物分子纳入本研究的考虑范围之内。

1.1.2 DYNT化学成分靶点的收集 通过药物名字匹配的方法在毒性与基因比较数据库(CTD)[13]和DrugBank[14]数据库进行检索,收集数据库收录的化学成分靶点数据。基于STITCH[15],BindingDB[16]和Swiss Target[17]数据库通过结构相似性匹配的方法预测各化学成分的靶点数据。为了提高数据的质量与可靠性,将STITCH、BindingDB和Swiss Target数据库的最低得分阈值分别设定为0.70、0.85和0.85,并依据靶点得分对靶点数据进行筛选。基于Uni-Prot[18]数据库检索各靶点的Gene Symbol,以此全面地收集DYNT化学成分的靶点数据。

1.1.3 脑卒中相关靶点的收集 以“Stroke”为检索词分别在DisGeNET[19]、PharmGKB[20]和CTD数据库进行检索,收集脑卒中相关靶点。

1.2 网络构建与分析

1.2.1 中药-成分-靶点网络 以疾病相关靶点和DYNT化学成分相关靶点作为输入,利用Venn Diagrams(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)在线分析工具进行韦恩图分析,确定两者的交集。将两者的交集作为限制条件,并基于Cytoscape 3.2.1[21]软件实现化学成分-靶点分子网络的可视化。

1.2.2 PPI网络 以疾病相关靶点和DYNT化学成分相关靶点的交集作为输入,基于STRING[22]数据库构建PPI网络图,利用Cytoscape 3.2.1软件实现网络的可视化。

1.2.3 MCODE cluster的网络聚类分析 利用Cytoscape 3.2.1中的MCODE cluster插件进行网络模块划分,识别DYNT治疗脑卒中的核心靶点网络。

1.2.4 KEGG通路和GO生物学过程富集分析 基于CTD数据库中的Enriched Biological Process功能模块和Enriched Pathways功能模块分别进行GO和KEGG富 集 分 析。

1.2.5 关键靶点的识别 利用Cytoscape软件中MCC和Stress两种算法,分别识别网络中排名前10的关键靶点。取两者的交集作为DYNT治疗脑卒中的关键靶点。

2 结果

2.1 DYNT化学成分及其靶点

通 过OB和DL筛 选TCMSP、TCMID和TCM-Mesh三个中草药数据库收录的DYNT相关化学成分,共收集到133个化学成分。其中包括灯盏细辛化学成分18个,银杏叶化学成分49个,三七化学成分24个,满山香化学成分42个。基于DrugBank、STITCH、BindingDB、Swiss Target和CTD等5个数据库收集并预测DYNT化学成分的靶点数据,共获得DYNT化学成分-靶点关系通路2236条,涉及靶点588个。

2.2 DYNT化学成分靶点与脑卒中相关靶点的重合度

基于DisGeNET、PharmGKB和CTD 3个数据库,本研究共收集到脑卒中相关基因330个。对DYNT化学成分靶蛋白与脑卒中相关靶点进行一致性分析,发现DYNT中共有153个靶蛋白与脑卒中相关,占全部脑卒中相关基因的46.36%(图1)。由此可推断DYNT可能通过这些靶蛋白实现对脑卒中的调控。

图1 DYNT化学成分靶蛋白与脑卒中相关基因重合度分析Fig.1 Analysis of coincidence degree between chemical component target proteins of DYNT and stroke-related genes

2.3 DYNT-化学成分-脑卒中相关基因网络

通过分析从DYNT中共获得木犀草素、山奈酚和芹菜素等59个药物成分参与脑卒中的调控,这59个成分构成了DYNT治疗脑卒中的有效成分群(图2)。

图2 DYNT-化学成分-脑卒中相关靶点网络Fig.2 Network of DYNT-chemical components and stroke-related targets

2.4 PPI网络

以STRING数据库收录的蛋白相互作用数据为背景网络,将DYNT参与调控的脑卒中相关基因映射至STRING数据库,构建DYNT治疗脑卒中的蛋白互作网络。该网络涉及节点153个,边4079条(图3)。

图3 DYNT治疗脑卒中蛋白互作网络Fig.3 DYNT protein interaction network in the treatment of stroke

2.5 MCODE cluster的网络聚类分析

以2.4构建的蛋白互作网络作为输入,基于MCODE cluster进行网络聚类分析,共识别出6个网络模块(图4)。

图4 DYNT治疗脑卒中蛋白互作网络MCODE cluster聚类分析结果Fig.4 Cluster analysis results of MCODE cluster of protein interaction network for DYNT in the treatment of stroke

2.6 DYNT治疗脑卒中潜在通路的发现

分别输入2.5中的6个网络模块,进行KEGG通路富集分析。得到DYNT治疗脑卒中的12条相关通路(表1)。

表1 DYNT治疗脑卒中的潜在通路Table 1 Potential pathway of DYNT in the treatment of stroke

2.7 DYNT参与调控脑卒中相关通路的GO富集分析

基于2.6识别出12条DYNT参与调控的脑卒中相关通路进行GO富集分析,得到GO生物过程729条,依据P值列出排名前25的生物过程。这些生物过程主要涉及细胞对内(外)源性物质刺激的反应、细胞代谢过程以及细胞凋亡、死亡过程(图5)。

图5 GO生物过程富集结果前25名Fig.5 Enrichment result of GO biological process:TOP25

2.8 DYNT治疗脑卒中关键靶点的识别

基于MCC和Stress两种算法分别识别排名前10的关键靶点,取二者交集作为DYNT治疗脑卒中的关键靶点,得到AKT1、MAPK3、TP53、IL6、VEGFA、TNF、INS和ALB 8个关键靶点(图6)。

图6 基于MCC和Stress算法的DYNT治疗脑卒中关键靶点网络图Fig.6 Network diagram of key targets of DYNT in the treatment of stroke based on MCC and Stress algorithms

3 讨论

缺血性脑卒中是由局部脑组织血液供应障碍引起的疾病,具有较高的发病率、致残率与病死率,是多环节、多因素、多途径损伤的复杂病理生理过程。DYNT治疗脑卒中涉及多成分、多靶点。通过网络药理学研究发现,木犀草素、山奈酚和芹菜素等59个成分构成了灯银脑通治疗脑卒中的有效成分群。谈心等[23]研究表明木犀草素可通过抗氧化应激反应改善脑出血后的神经功能障碍与认知障碍;向丽等[24]研究发现山奈酚可通过调节TLR4(Toll-like receptor 4)/NF-κB通路表达对局灶性脑缺血再灌注损伤具有神经保护作用;涂丰霞等[25]研究表明芹菜素可促进脑血管再生而改善脑缺血损伤后神经功能障碍;王凯华等[26]研究发现柚皮素可改善脑卒中后脑损伤及阿尔茨海默病模型大鼠的认知能力;刘骥飞等[27]研究表明黄芩素可通过抗氧化应激、抗凋亡等机制改善脑缺血后神经功能障碍及脑组织水肿。

通过KEGG通路富集分析得到PI3K-Akt、HIF-1、Toll-like receptor、Apoptosis、MAPK、JAKSTAT、Sphingolipid、NF-κB、AMPK、Wnt、m TOR和Linoleic acid metabolism这12个DYNT治疗脑卒中的信号通路。通路富集分析结果与中药多靶点、多途径治疗疾病的特点相一致。目前对DYNT治疗脑卒中的信号通路研究较少,在文献研究过程中发现通过调节上述信号通路可发挥对脑卒中的治疗作用。血脑屏障功能的破坏是脑组织的病理变化之一,刘禹等[28]研究发现三七总皂苷联合针灸治疗可通过PI3K/Akt通路对急性缺血性脑卒中大鼠血脑屏障具有显著的保护作用。Wnt通路在缺血性脑卒中后可维持血脑屏障的完整性,从而改善因脑卒中造成的血脑屏障损伤而加剧的水肿和出血等并发症[29]。炎症在缺血性脑卒中发病机制中起着重要作用。研究表明大脑缺血性损伤后诱导Toll样受体家族(TLRs)受体有利于改善缺血后炎症[30]。冯毅慧等[31]研究发现MAPK信号通路可通过调节细胞凋亡来实现对脑组织的保护,脑损伤后的炎症反应会引起IL-1β、IL-6和TNF-α的过量表达,进而诱导炎症级联反应,加重脑损伤。NF-κB以其活性形式调控促炎症和促凋亡基因的表达。缺血性中风发生时,大脑动脉或其分支被阻塞,导致炎症过程激活,引起继发性组织损伤、血脑屏障破坏、水肿或出血[32]。杨丽梅等[33]研究表明,灯盏花素通过抑制TLR4/NF-κB信号通路来减轻大鼠皮质神经元自噬和炎症损伤。神经元死亡是脑卒中最显著的病理变化,也是导致脑功能损伤的主要原因[34]。Wei等[35]研究表明抑制神经元的凋亡,可有效延长缺血性脑卒中的治疗时间窗。Gong等[36]研究表明,抑制JAK/STAT通路的表达,可抑制神经细胞的凋亡,促进脑卒中后中枢神经系统功能恢复,对脑卒中后的神经损伤起保护作用。鞘脂(sphingolipid)信号分子参与细胞的死亡和存活、增殖、识别和迁移等过程,在缺血性卒中、出血性卒中以及卒中后修复过程中发挥关键作用,通过激活鞘脂代谢通路来减少脑卒中诱导的脑损伤、减少神经元死亡[37]。Hou等[38]研究发现通过激活JAK2/STAT3可间接上调PI3K/AKT/m TOR途径,改善神经功能,减少脑梗死体积,减少神经元损伤,并显著减弱神经元凋亡。促进脑卒中后新生血管的生成可改善脑卒中症状。缺氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)是血管生成的主要调节因子,结构上由两个亚基组成,其中HIF-1α可促进血管的生成,改善脑卒中症状。AMP激活的蛋白激酶(AMPK)可通过减弱氧化应激、调节神经元自噬和凋亡、促进新生血管生成等方式改善脑卒中症状[39]。在文献回顾的过程中我们并未发现Linoleic acid metabolism信号通路与治疗脑卒中的相关报道,有待进一步的研究。

基于MCC和Stress两种算法得到AKT1、MAPK3、TP53、IL-6、VEGFA、TNF、INS和ALB等8个治疗脑卒中的关键靶点。血管平滑肌细胞(VSMC)是动脉粥样硬化斑块的重要组成部分,调节代谢、增殖、细胞存活、生长以及血管生成,负责促进晚期病变中的斑块稳定性,Akt1的整体缺乏会导致血管生成受损和大动脉粥样硬化[40-41]。赵帅等[42]研究表明可通过MAPK3治疗缺血性脑卒中,激活细胞生存信号和抑制神经细胞凋亡的调控表达;此外,通过调节ALB的表达可抑制血小板聚集,发挥抗血栓形成作用。血管内皮生长因子(VEGF)家族是血管生成、神经保护和神经发生的重要调节因子,其中对VEGFA的关注度较高,VEGF的失调与多种神经疾病有关[43]。有研究表明,灯盏草乙素能提高VEGF在体内的表达从而促进血管的形成,达到改善脑缺血再灌注损伤的作用[44]。Wei等[45]研究发现,脑缺血患者与健康受试者相比TP53启动子的甲基化状态显著增加,降低TP53表达可保护转基因小鼠免受局部缺血性损伤。TP53的蛋白表达水平在缺血性脑损伤后被上调,可诱导细胞凋亡和内皮损伤,加剧脑损伤。肿瘤坏死因子(TNF)和IL-6是强有力的炎症细胞因子,可调节实验性卒中的组织损伤,局部缺血区域中细胞因子水平可影响梗死演变[46]。胰岛素(INS)抵抗通过增强动脉粥样硬化的晚期变化在缺血性脑卒中的发病机制中起重要作用。有关文献表明,胰岛素抵抗增强了血小板的粘附、活化和聚集,从而增加缺血性中风的发生[47]。

综上所述,DYNT可通过多成分、多靶点、多途径实现对脑卒中的调控,并推测相关化学成分可通过作用于特定的靶点和通路,抑制炎症反应、抗氧化应激反应、保护血脑屏障、修复神经血管单元等途径改善脑卒中症状。本研究基于网络药理学挖掘灯银脑通胶囊治疗脑卒中的有效成分群并对相关作用靶点进行预测,为后期作用机制的研究提供理论支持。