响应面法优化子囊霉素发酵工艺

严凌斌，张祝兰，陈洲琴，张 引，邱观荣，连云阳

(福建省微生物研究所 福建省新药(微生物)筛选重点实验室，福建 福州 350007)

子囊霉素(Ascomycin，FK-520)是从链霉菌发酵产物中分离得到的一种二十三元大环内酯类抗生素[1]，是一种非常有价值的多功能药物[2]，具有多种生物活性，如免疫抑制[3]、抗疟疾[4]、抗真菌、抗痉挛[5]、神经再生与恢复[6]等，已被广泛应用于临床上治疗器官移植排斥反应、自身免疫疾病及多种皮肤疾病[7]。除作为活性药物成分外，子囊霉素也是合成其衍生物吡美莫司的起始成分，由于侧链基团的变化，该衍生物成为具有增强活性的子囊霉素的替代品，目前用于特应性皮炎(轻中度)的一线治疗，也可用于银屑病、脂溢性皮炎和白癜风等皮肤炎症性疾病的治疗[8]。

子囊霉素具有广阔的应用及市场前景，但由于其大环内酯结构复杂、化学合成困难、副产物多且产量较低，限制了其商业化生产。目前利用吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)进行微生物发酵是国内外工业生产子囊霉素的首选工艺。该工艺存在产量较低、成本较高等问题，多年来研究人员一直致力于提高子囊霉素产量的研究工作，现已取得了较大的进展[8-11]。作者采用响应面法对子囊霉素的发酵培养基及发酵条件进行优化，经Plackett-Burman设计(PBD)筛选对子囊霉素产量有显著影响的关键变量，采用最陡爬坡实验确定响应面分析中心点，再进一步利用中心组合设计(CCD)与响应面分析获得关键变量的最优值，以期提高子囊霉素产量，为其放大生产奠定基础。

1 实验

1.1 菌种、试剂与仪器

吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)FIM-38-24[11]，保藏于福建省微生物研究所。

子囊霉素标准品，上海齐奥化工科技；糊精，山东西王糖业；黄豆粉，福建宝佳；酵母粉，安琪酵母；蛋白胨，福建仙游三和生物科技；玉米浆粉，上海缘肽生物技术；BR级琼脂粉，广东环凯微生物科技；色谱纯乙腈，德国默克；其它试剂均为分析纯。

1360B型超净工作台，北京亚泰科隆；MIR-253型微生物培养箱，日本三洋；ZHWY-2102型大型恒温摇床，上海智城分析仪器制造；Allegra X-15R型离心机，美国BECKMAN；LC-20A型高效液相色谱仪，日本岛津。

1.2 发酵方法

固体培养基、种子培养基及发酵培养基均按文献[11]方法配制，吸水链霉菌FIM-38-24的孢子培养、种子培养及发酵培养均按文献[11]方法进行。

采用高效液相色谱法(HPLC)测定子囊霉素产量[11]。

1.3 发酵工艺优化

1.3.1 PBD实验

当不考虑因素间的交互作用时，PBD是一种用于筛选关键变量的非常有效且快速的方法[12]。采用PBD实验筛选对子囊霉素产量有显著影响的关键变量。以子囊霉素产量为响应值，分别在高水平(1)及低水平(-1)下，对10个变量(7个培养基组分和3个发酵条件)的显著性进行评估。PBD实验各变量的水平与编码见表1。

表1 PBD实验各变量的水平与编码

1.3.2 最陡爬坡实验

实验操作条件的初始估计值通常与实际最优值存在差距，采用最陡爬坡实验确定响应面分析中心点，使初始估计值快速接近实际最优值。对于PBD实验中的一阶模型，响应面轮廓是一系列平行线。最陡上升的方向是响应值增长最迅速的方向，该方向是垂直于拟合的响应面轮廓。最陡爬坡的路径通常是穿过垂直于拟合曲面轮廓区域中心的直线，因此，爬坡路径的步长与回归系数成正比[13]。最陡爬坡实验从PBD实验中变量的低水平开始，沿着所计算的步长和方向移动。

1.3.3 CCD实验

基于PBD实验筛选的对子囊霉素产量有显著影响的关键变量和最陡爬坡实验确定的响应面分析中心点，进一步采用CCD与响应面分析相结合的方法优化影响子囊霉素产量的关键变量并分析它们之间的交互作用。CCD实验关键变量的水平与编码见表2。

表2 CCD实验关键变量的水平与编码

CCD实验后，每组数据将被拟合到一个独立的二阶多项式模型[式(1)]中，计算二阶多项式系数。通过Design Expert Version 8.0软件分析CCD实验数据，通过方差分析(ANOVA)解决模型的统计学问题。

(1)

i,j=1,2,…,k

i≠j

式中：Y为预测响应值；β0为截距；Xi、Xj均为变量；βi为线性系数；βii为二次系数；βij为交互作用系数。

2 结果与讨论

2.1 PBD实验结果(表3)

表3 PBD实验设计与结果

将PBD实验结果拟合为一阶多项式方程:Y=593.25+39.25A+31.25B+2.42C-6.92D-3.42E-2.92F-1.58G-1.75H+0.92I+29.25J，各变量的系数表示该变量对子囊霉素产量的影响程度。

PBD实验的方差分析见表4。

由表4可知，模型的P值为0.031 4，表明模型具有非常良好的显著性；糊精(A)、黄豆粉(B)、发酵时间(J)对子囊霉素产量有显著影响(P<0.05)；决定系数R2为0.999 8，说明模型具有指导后期设计的意义。因此，后续实验将选择糊精、黄豆粉、发酵时间作为关键变量进行进一步的优化，以获得最大响应值。

表4 PBD实验的方差分析

2.2 最陡爬坡实验结果

根据PBD实验拟合得到的一阶多项式方程确定最陡爬坡实验的路径和方向，并进一步计算其步长，结果见表5。

表5 最陡爬坡实验设计与结果

由表5可知，随着糊精、黄豆粉含量的增加和发酵时间的延长，子囊霉素产量沿着路径1到5逐渐升高，在路径5时达到最高(719 mg·L-1)，而后沿着路径5到7逐渐降低。这意味着关键变量的最优值接近路径5实验值，即糊精75 g·L-1、黄豆粉28 g·L-1、发酵时间136 h。

2.3 CCD实验结果

采用CCD设计20组实验对影响子囊霉素产量的关键变量及其交互作用进行分析，结果见表6。

表6 CCD实验设计与结果

CCD实验的方差分析见表7。

由表7可知，模型P值小于0.000 1，说明模型具有统计学意义，实验数据可信；模型F值为55.387 57，说明模型显著性良好；模型拟合系数R2为0.980 3，说明模型拟合度较好，可用于分析预测子囊霉素的最优产量。本实验的信噪比为19.736(大于4为可取)。

2.4 响应面交互作用分析

利用三维响应面图和二维等高线图可以阐明响应值与各影响因素相互作用的关系。在所有图中，2个变量在实验范围内线性变化，另一个变量在中心点处保持不变。在二维等高线图中，等高线的形状可用于判断不同变量间交互作用的显著性，越偏向椭圆代表交互作用越显著，越偏向圆形代表交互作用越不显著[13]。根据糊精、黄豆粉和发酵时间交互作用的响应面图及等高线图(图1)并结合方差分析(表7)，发现糊精与黄豆粉的交互作用、糊精与发酵时间的交互作用对子囊霉素产量的影响均具有显著性。

(a)糊精与黄豆粉的交互作用 (b)糊精与发酵时间的交互作用 (c)黄豆粉与发酵时间的交互作用

表7 CCD实验的方差分析

2.5 最优发酵条件的确定

利用Design Expert 8.0软件对统计模型进行分析，并对回归方程求导，得到影响子囊霉素产量关键因素的理论最优值为：糊精75.98 g·L-1、黄豆粉27.79 g·L-1、发酵时间138.45 h，在此条件下进行3组验证实验，将结果与预测最优值进行比较来确定模型是否有效。验证实验得到的子囊霉素平均产量为743 mg·L-1，与预测值739.136 mg·L-1基本吻合，表明该模型合理可靠。为便于操作，确定糊精75 g·L-1、黄豆粉28 g·L-1、发酵时间138 h，在此优化条件下子囊霉素产量较优化前提高了46.8%。

3 结论

通过PBD实验，确定糊精、黄豆粉和发酵时间是影响子囊霉素产量的关键变量，通过最陡爬坡实验确定响应面分析中心点，进一步采用CCD实验与响应面分析相结合的方法确定糊精、黄豆粉和发酵时间的最优值分别为75 g·L-1、28 g·L-1、138 h，在此优化条件下子囊霉素产量可达743 mg·L-1，较优化前提高了46.8%。