水铁矿驱动Feammox处理污泥消化液中的氨氮

梁松，杨亚飞，张耀斌

(大连理工大学 环境学院，辽宁 大连 116024)

目前，有关Feammox的研究主要集中于自然环境中的物质迁移转化和元素循环[3-6]。但在废水脱氮方面，由于Feammox发现较晚，目前的少量报道主要以人工配制废水为主[7-8]，且缺乏15N标记同位素等手段进行证实。另一方面，Feammox与异化铁还原密切相关[9]。据报道[10]，腐殖质结构上具有的羟基/醌基可用作电子穿梭体，提高异化铁还原效率。但腐殖质是否可以用于加快Feammox的报道较少。

笔者将稀释后的污泥消化液作为处理对象，向厌氧反应器内投加水铁矿，尝试驱动Feammox过程并探究其对氮去除效果的影响；利用同位素标记、微生物群落分析等方法研究脱氮与Feammox的相关性；投加腐殖质探究其对Feammox脱氮的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.2 水铁矿合成 使用的水铁矿根据Cornell等[11]的方法合成，即在磁力搅拌条件下向FeCl3·6H2O溶液中逐滴加入1 mol/L NaOH溶液，调节pH值为7.0～7.6，得到褐色悬浮状水铁矿后静置并吸去上清液，用去离子水重复洗涤离心(8 000 r/min，10 min)3次，去除多余的去离子水后冷冻干燥，获得实验所用水铁矿。

表1 实验所用污泥消化液的主要初始指标

1.1.4 腐殖质 实验所用腐殖质为阿拉丁试剂(上海)有限公司所生产的腐植酸，主要成分为黄腐酸，CAS为1415-93-6。

1.2 实验方案及测试方法

1.2.1 实验设置 实验开始前，将无菌缺氧的去离子水与经过驯化后的引种污泥按照体积比3∶1的比例充分混合，在黑暗中于25 ℃预培养3 d，以去除背景氮氧化物，去除上清液后的污泥用作实验接种污泥，主要初始指标如表2所示。向100 mL血清瓶中加入7 mL已去除上清液的接种污泥和70 mL稀释后的污泥消化液。设置实验方法(每组9个血清瓶)：1)未投加水铁矿的对照组；2)投加水铁矿的水铁矿组；3)投加水铁矿和腐殖质的腐殖质组。用丁基橡胶隔片密封血清瓶，并用铝盖压盖后用超高纯氩气冲洗血清瓶以排出空气，然后将其置于充满氩气的厌氧手套箱中，该手套箱放置于恒温房中。

表2 实验所用接种污泥的主要初始指标

每间隔2 d从血清瓶中进行破坏性采样，每个血清瓶采样2次后丢弃。取样前，剧烈摇晃血清瓶以混匀样品，取样在充满氩气的厌氧手套箱中操作。

1.2.215N同位素标记实验 同位素标记培养所使用的培养基组分为：MgCl2·6H2O(0.4 g/L)、CaCl2·H2O(0.1 g/L)、15NH4Cl(0.1 g/L)和KH2PO4(0.6 g/L)、1 mL/L维生素溶液、1 mL/L微量元素溶液、30 mmol/L碳酸氢盐缓冲液和2 mmol/L乙酸盐[12]。所有实验的接种污泥处理方法和实验方法设置全部一致。同位素标记培养基在厌氧手套箱中培养30 d后，使用配有质谱分析仪的气相色谱仪(GC/MS, QP2020)检测厌氧反应器顶空气体中30N2的生成(色谱柱类型为SH-RXI-5silMS，气体手动进样，进样口温度280 ℃，质谱扫描范围12～32 m/z，全扫描)。顶空气体中的N2体积通过带有热导检测器(TCD)的气相色谱仪(Tianmei, GC-7900P/TCD, 中国)进行测定。

采用分步提取法对反应器内不同铁氧化物进行提取并对其各自所占比例进行计算[14-16]。

第48天的对照组和水铁矿组反应器内的污泥样品委托上海美吉生物公司通过高通量16S rDNA测序进行微生物群落分析：根据 E.Z.N.A.© soil DNA kit (Omega Bio-tek, Norcross, GA, U.S.)说明书进行微生物群落总DNA抽提，使用338F (5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R (5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)对16S rRNA基因V3-V4可变区进行PCR扩增，扩增之后的产物经过回收纯化和检测定量后利用Illumina公司的Miseq PE300/NovaSeq PE250平台进行测序。

同时委托上海美吉生物公司进行基于RNA的实时定量PCR分析(qPCR)，用于进一步确定某些功能性基因的绝对数量和活性[17]。使用引物组1055f/1392r对16S rRNA基因进行总细菌定量表示。使用引物组Amx368f/Amx820r鉴定量化Anammox功能菌，Feammox功能微生物Geobacteraceae和AcidimicrobiaceaeA6细菌分别使用引物组Geo494F/Geo825R和acm342f/439r进行鉴定量化[18-19]。具体的引物信息如表3所示。

表3 用于扩增的实时定量 PCR 引物

2 试验结果与讨论

2.1 投加水铁矿对氨氮去除的影响

图1 实验过程中氨氮及硝态氮的浓度变化

为了进一步研究投加水铁矿对氮去除的影响，对实验前后的总氮进行测定(图1(d))。结果表明，水铁矿组的总氮去除率为57.5%，而对照组仅为2.5%，表明向厌氧反应器中投加水铁矿可以显著提高氮的去除率。

2.2 Fe(Ⅱ)浓度变化

图2 实验过程中Fe(Ⅱ)浓度变化

图3 实验后水铁矿组中污泥的 XRD 图谱

2.3 同位素标记结果分析

表4 厌氧条件下产生30N2和29N2的可能的途径[24]

图4 同位素标记培养实验中30N2和29N2产量

2.4 微生物群落分析

到目前为止，Feammox的功能性微生物尚未被完全阐明，大多数研究认为铁还原菌是Feammox的功能微生物[12, 25]。在本研究中，水铁矿组中的铁还原菌被富集。对比对照组和水铁矿组，在属水平，Geobacter在水铁矿组中的相对丰度为0.54%，而在对照组中仅为0.003 6%，相差约150倍。

表5 对照组与水铁矿组内部分铁还原菌的相对丰度

此外，Huang等[19]在河岸湿地中发现了另一种在Feammox中起重要作用的微生物(AcidimicrobiaceaeA6菌)，其被确认为是Feammox的功能微生物。在本研究中，尽管在16S rDNA高通量测序中未检测到AcidimicrobiaceaeA6细菌，但基于RNA的实时定量PCR分析(qPCR)结果显示，在水铁矿组和对照组中AcidimicrobiaceaeA6细菌的拷贝数分别为4.15×107和4.90×106，这一差距表明，作为Feammox功能微生物的AcidimicrobiaceaeA6细菌在投加Fe(Ⅲ)的厌氧反应器中表达得更为活跃。

特别地，16S rDNA高通量测序结果和qPCR中都未检测到Anammox菌或Anammox基因，进一步证明了氨氮的去除并非由Anammox导致。

2.5 投加腐殖质对脱氮效果的影响

异化铁还原过程中，微生物将电子传递至胞外不溶性铁氧化物，是其呼吸代谢的制约性步骤。同时，反应过程中生成的Fe(Ⅱ)不断沉积在铁氧化物表面并与其进行电子交换，导致次生矿物生成，铁氧化物晶型不断向更稳定状态转化，使微生物难以利用。上述原因导致了异化铁还原的速率逐步降低。一般说来，小分子有机物可作为有机碳源被微生物吸收用于生长，而腐殖质为大分子有机物，难以进入细胞内部为微生物提供生长所需碳源。据报道[10]，腐殖质以电子穿梭体的作用存在于异化铁还原过程中。为探究腐殖质在Feammox过程中的作用，在投加水铁矿的同时向反应器内投加腐殖质。

在厌氧培养48 d后，水铁矿组和腐殖质组反应器内Fe(Ⅱ)浓度最终分别为1 138.33、1 839.18 mg/L，相应的Fe(Ⅱ)生成率分别为23.72、38.32 mg/(L·d)，反应器内Fe(Ⅱ)的生成速率提高了近一倍。根据第48天两组反应器内二价铁浓度对铁还原率进行核算，结果如图5所示，水铁矿组和腐殖质组反应器内的铁还原率分别为46.18%和89.36%，铁还原率提高了40%以上。结果表明，投加腐殖质后，通过促进异化铁还原过程提高了Feammox的反应速率。

图5 反应器内最终Fe(Ⅱ)浓度及铁还原率

图6为单独投加水铁矿和同时投加水铁矿和腐殖质组内样品的扫描电子显微镜(SEM)图像，可以看到，未投加腐殖质的反应器内块状磁铁矿颗粒更清晰，体积更大，数量较多，分布更密集；而投加了腐殖质的反应器内混合物的形态更为蓬松，颗粒状晶型不明显，数量少，分布散，体积也更小。结果表明，向反应器内投加腐殖质可以减缓反应器内结构松散的铁氧化物向结构密实的高结晶态铁氧化物的转化进程。

图6 第48天反应器内铁氧化物形态

X射线光电子能谱(XPS)分峰拟合结果如图7所示，水铁矿组样品的Fe 2p图谱在723.1、710.61 eV处出现两个峰，分别对应了Fe3O4的Fe 2p1/2和Fe 2p3/2自旋轨道跃迁[26]，说明反应器内生成了高结晶态的磁铁矿，而腐殖质组样品的Fe 2p图谱在724.6、710.8 eV处出现两个峰，对应了Fe2O3的存在，该结果与SEM结果吻合，表明投加腐殖质可减慢水铁矿的晶型转变速度。

图7 第48天反应器内样品Fe 2p扫描XPS图谱

此外，对比两组样品的Fe 2p扫描图谱可以发现，水铁矿组样品的图谱更为平滑，而腐殖质组样品的图谱上有许多噪音信号，说明该样品表面的含铁量较少，而腐殖质的投加并不会改变样品表面的含铁量，原因可能是腐殖质覆盖在铁氧化物的表面并与其结合，这种作用会加速电子传递，进而提高反应速率。

对反应结束后的水铁矿组和腐殖质组内不同铁氧化物进行提取，确定其各自占总量的比例，结果如图8所示。两组样品中主要以易还原的羟基氧化铁(水铁矿和纤铁矿)和结晶态的铁氧化物形式存在，水铁矿组和腐殖质组内易被还原态的铁氧化物占比分别为41.92%和52.44%，结晶态的铁氧化物占比分别为55.21%和41.63%。可以看到，在投加了腐殖质的反应器内易被还原形态的铁氧化物所占比例最高，而未投加腐殖质的反应器内高结晶态铁氧化物含量最高，表明腐殖质在一定程度上可以阻止部分铁氧化物向晶型更为稳定的铁矿物转化。

图8 反应器内铁氧化物的形态分布

3 结论

向污泥消化液中投加水铁矿驱动厌氧反应器中Feammox过程发生，研究投加Fe(Ⅲ)对氮去除效果的影响，得到以下主要结论：

3)微生物群落分析结果表明，投加水铁矿后在反应器内富集了Geobacter等多种铁还原菌；qPCR结果表明，投加水铁矿的反应器内Feammox功能微生物AcidimicrobiaceaeA6菌表达活跃，说明反应器内的氮去除与Feammox有关。

4)反应器内的铁氧化物组成及形态分析表明，腐殖质除了以电子穿梭体进行作用外，还可通过减缓铁氧化物钝化，增强异化铁还原而提高Feammox效率。

利用水铁矿驱动了Feammox脱氮，而腐殖质进一步促进了该过程，氮去除率进一步提高。需要指出的是，Feammox过程中氨氮去除需要较长反应时间，这可能与Feammox的自养方式有关，也与异化铁还原的胞外电子传递相关。可以在微生物富集、强化，以及提高胞外电子传递等方面进一步开展研究。

区别于传统生物脱氮方式，该方法可在厌氧消化器内实现脱氨氮，前提是需要Fe(Ⅲ)的持续投加。连续投加Fe(Ⅲ)看似不易，但对于富含Fe(Ⅲ)的芬顿污泥，可将其用作三价铁源。尤其对具备较长处理时间条件的垃圾填埋场，Feammox可以作为一种有较好应用前景的生物脱氮技术。